方 雪

（合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)系，安徽 合肥230601）

水稻是世界主要糧食作物之一，占世界糧食作物產(chǎn)量的40%［1］。近年來(lái)，水稻基因組研究進(jìn)展迅速，隨著水稻全基因組序列的測(cè)序的的完成，水稻分子生物學(xué)研究進(jìn)入功能基因組時(shí)代［2－3］。水稻節(jié)間生長(zhǎng)發(fā)育有著特定的時(shí)空模式，有多個(gè)基因參與調(diào)控水稻節(jié)間發(fā)育［4，5］。

Takeda曾將水稻矮桿突變體依據(jù)其對(duì)節(jié)間排布模式的影響而分為五類：dn、dm、d6、sh、nl。其中dn型水稻突變體中每個(gè)節(jié)間均勻縮短，其伸長(zhǎng)形式跟野生型相似；dm型突變表現(xiàn)為第二節(jié)間特異縮短；sh和d6型突變體則是倒一節(jié)或是倒二節(jié)縮短［6］。隨著近年來(lái)水稻功能基因組研究的迅猛發(fā)展，許多與這五類突變相關(guān)的基因已被鑒別和克隆。已克隆出的基因OSH15、OSBRI1的突變可以造成d6表型［7］；本研究中克隆的OEUI的突變可以造成sh表型。多個(gè)EUI基因則特異調(diào)控倒一節(jié)的伸長(zhǎng)模式。對(duì)這些基因的克隆以及相關(guān)的生物學(xué)研究將極大地促進(jìn)人們理解水稻節(jié)間模式形成的分子機(jī)理［8，9］。

經(jīng)典的植物學(xué)研究早已表明植物激素赤霉素對(duì)于節(jié)間的伸長(zhǎng)是必須的，EUI基因還與赤霉素的合成代謝以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，許多與赤霉素合成、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的突變體都表現(xiàn)出節(jié)間伸長(zhǎng)的缺陷［10］。另外，油菜素內(nèi)酯和生長(zhǎng)素都對(duì)節(jié)間的伸長(zhǎng)有著重要的作用［11］。因此，可以利用節(jié)間伸長(zhǎng)探討赤霉素、油菜素內(nèi)酯和生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的關(guān)系。水稻生產(chǎn)中，水稻雄性不育系中普遍存在的“包頸”現(xiàn)象（即倒一節(jié)間伸長(zhǎng)受阻），印證了在頂端發(fā)育的穗與倒一節(jié)間的居間分生組織之間存在長(zhǎng)距離信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)［12］。在已克隆的基因中，OSH15編碼了一個(gè)同源異形盒（homeo－domain）蛋白；OSBRI1編碼的蛋白是油菜素內(nèi)酯的受體，OSH15、OSBRI1的突變可以造成相似的d6表型，提示激素BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與同源異形盒基因之間的互作關(guān)系［13，14］。

圖位克隆是近年來(lái)隨著各種植物的分子標(biāo)記圖譜的相繼建立而發(fā)展起來(lái)的一種新的基因克隆技術(shù)。根據(jù)功能基因在基因組中都有相對(duì)較穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫(kù)（包括 YAC、BAC、TAC、PAC或cosmid文庫(kù)），從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過(guò)染色體步移逐步逼近目的基因或通過(guò)染色體登陸的方法最終找到包含該目的基因的克隆，并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)目的基因的功能［15］。2003年朱宏波用圖位克隆的策略將EUI2基因定位于一個(gè)41.7kb的區(qū)間內(nèi)，并成功克隆到該基因。僅知道EUI2同樣與赤霉素有關(guān)，但對(duì)EUI2的功能研究尚未見報(bào)道［16］。

目前幾乎所有重要農(nóng)作物，如水稻、擬南芥、番茄、玉米、甜菜、小麥、大豆、馬鈴薯、棉花、油菜等的RFLP圖譜均已構(gòu)成，隨著多種標(biāo)記的不斷添加與定位，分子遺傳圖譜正日漸趨于飽和。2001年Cornell大學(xué)發(fā)表的SSR遺傳連鎖圖上SSR標(biāo)記達(dá)到500多個(gè)，而2002年IRMI圖譜上則整合了2240個(gè)新開發(fā)的SSR標(biāo)記。水稻全基因組序列的完成，為水稻分子遺傳學(xué)研究提供無(wú)窮的分子標(biāo)記和序列信息，必將對(duì)水稻基因圖位克隆技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用。

本研究中的OEUI基因的表型為水稻倒一節(jié)伸長(zhǎng)受阻，該表型由γ射線誘變水稻種子得到，為單基因隱性突變。為深入研究該基因的功能，采用圖位克隆法，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，依靠PCR擴(kuò)增進(jìn)行全基因組掃描，確定OEUI基因在染色體中的位置，尋找與OEUI基因連鎖的遺傳標(biāo)記，最終對(duì)OEUI基因進(jìn)行精細(xì)定位，從而研究其功能。

1 材料與方法

1.1 定位群體的構(gòu)建和總DNA的提取

通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的水稻突變體庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模篩選，獲得一穩(wěn)定遺傳的單基因隱性突變體oeui。oeui為輻射處理野生型中花11（ZH11）的種子產(chǎn)生誘變獲得。以oeui突變體和龍?zhí)馗Γ↙TF）為親本構(gòu)建F2群體，用于OEUI基因的初步定位。從F2代中選取30株顯性正常株和54株突變株構(gòu)成定位群體，分單株取葉片提取總DNA。在此基礎(chǔ)上隨機(jī)選取正常株和突變株各10株，取等量葉片，混合研磨后提取DNA，建成混合池。參照 Mc－Couch等的方法提取總DNA［17］。

1.2 篩選與目標(biāo)基因連鎖的SSR標(biāo)記

利用日本水稻基因組計(jì)劃（RGP）公布的1號(hào)染色體的有關(guān)信息，設(shè)計(jì)并合成SSR引物。對(duì)突變體oeui和正常株的基因組DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增，PCR按常規(guī)方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如果PCR產(chǎn)物在親本間具有多態(tài)性，直接用作分子標(biāo)記；如果沒(méi)有多態(tài)性，則將擴(kuò)增產(chǎn)物用不同的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，表現(xiàn)多態(tài)者則用作SSR分子標(biāo)記。

1.3 基因初定位

用開發(fā)出的SSR標(biāo)記對(duì)龍?zhí)馗Γ痮eui突變體F2群體中的突變體進(jìn)行分析，將OEUI基因所控制的性狀按雙親表型分為2群，每一群中各個(gè)體DNA等量混合，形成2個(gè)DNA混合池（倒一節(jié)間伸長(zhǎng)和倒一節(jié)間伸長(zhǎng)受阻）。用OEUI基因附近的SSR標(biāo)記對(duì)混合DNA樣品池進(jìn)行分析，根據(jù)基因池中包含有交換的DNA池的比例確定與OEUI基因連鎖最緊密的分子標(biāo)記和OEUI基因附近所有分子標(biāo)記的順序。SSR標(biāo)記的分析結(jié)果利用Mapmaker 3.0作圖軟件進(jìn)行連鎖分析及遺傳距離計(jì)算。

1.4 基因精細(xì)定位

以oeui突變體和廣陸矮4號(hào)（GLA4）為親本構(gòu)建F2群體，用于OEUI基因的精細(xì)定位。把目標(biāo)基因初步定位在2個(gè)標(biāo)記之間后，從國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃（IRGSP）公布的序列中下載這2個(gè)標(biāo)記區(qū)域的部分SSR標(biāo)記。對(duì)擴(kuò)增良好并表現(xiàn)出多態(tài)性的引物分別在定位群體中的oeui突變株上作分析，將目標(biāo)基因范圍縮小到一個(gè)很小的基因組區(qū)域并應(yīng)用于精細(xì)定位分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OEUI基因初步定位群體的構(gòu)建：

OEUI基因初步定位群體來(lái)源于龍?zhí)馗Γ↙TF）／oeui突變體的F2中的突變表型株，共64株。突變體植株矮化，倒一節(jié)間生長(zhǎng)受阻，突變體不結(jié)實(shí)。形態(tài)特征如圖1。

圖1 突變體與其野生型親本的植株形態(tài)

2.2 OEUI基因連鎖引物的篩選

隨機(jī)挑選10株突變體，構(gòu)建DNA混合池，以中花11、龍?zhí)馗?、F1、DNA混合樣為模板，全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)水稻第一染色體標(biāo)記RM3252可能與基因OEUI連鎖，用RM3252擴(kuò)增64株龍?zhí)馗Γ痮eui突變體的F2中的突變表型株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有三株表現(xiàn)F1帶型，即為交換單株（圖2），其余均與中花帶型一致，因此認(rèn)為SSR標(biāo)記RM3252與OEUI基因連鎖。

圖2 標(biāo)記RM3252對(duì)部分LTF／oeui的F2突變株DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖（含箭頭所指帶型的單株為交換株）

2.3 OEUI基因的初步定位

用64株LTF／oeui突變體將OEUI基因初步定位在RM4554與RM5552之間，它們之間的遺傳距離約14.8cm。

2.4 OEUI基因的精細(xì)定位

OEUI基因的精細(xì)定位群體來(lái)源于廣陸矮4號(hào)（GLA4）／oeui突變體的F2中的突變表型株，共504株。

在初定位的基礎(chǔ)上進(jìn)一步在RM4554與RM5552之間發(fā)展SSR分子標(biāo)記，在親本表現(xiàn)多態(tài)的有效引物有八對(duì)，分別為：RM3148，RSL0126／0127，RSL0114／0115，RSL0108／0109，RSL0160／0161，RSL0168／0169，RSL0172／0173與 RSL0152／0153。其中RSL0126／0127是在緊接RM3148后的BAC AP002867 中設(shè)計(jì)的，RSL0114／0115，RSL0108／0109是在緊接 AP002867后的 BAC AP002747中設(shè)計(jì)的，RSL0160／0161，RSL0168／0169，RSL0172／0173 是在 RM3148 與 RSL0152／0153中部的BAC AP002868中設(shè)計(jì)的（圖3）。

圖3 八對(duì)有效引物在染色體上的位置

通過(guò)擴(kuò)增504株F2表型突變株發(fā)現(xiàn)：RM3148擴(kuò)增504株F2突變株，交換單株編號(hào)為87，124，164，208，257，297，316，376，共八株（圖4）。

圖4 RM3148對(duì)部分GLA4／oeui的F2突變株DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖

RSL0152／0153擴(kuò)增504株F2突變株，交換單株編號(hào)為12，15，46，66，68，88，110，124，125，128，135，137，161，166，176，185，234，236，251，257，273，283，285，289，291，295，300，317，332，341，347，348，354，358，366，369，370，375，379，390，396，399，433，435，444，450，468，470，共48株。用前八對(duì)可用引物擴(kuò)增RM3148的八株交換單株，結(jié)果如表1。

表1 八對(duì)可用引物擴(kuò)增RM3148的八株交換單株

分析F2群體的504株倒一節(jié)間伸長(zhǎng)受阻表型個(gè)體，檢測(cè)出重組個(gè)體并驗(yàn)證區(qū)間走勢(shì)，最終把OEUI基因定位在SSR標(biāo)記RM3148和RSL0152／0153之間，它們之間的物理距離約為876kb，遺傳距離為3.9cm。

3 討論

本研究首先利用64株LTF／oeui突變體，采用集團(tuán)分離分析法篩選到與OEUI基因連鎖的標(biāo)記RM3252。隨后運(yùn)用在親本間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記篩選F2定位群體，將目標(biāo)基因定位在1號(hào)染色體上的標(biāo)記RM3148和RSL0152／0153之間。根據(jù)已經(jīng)公布的水稻全基因組序列，查找到標(biāo)記RM3148與SL0152／0153之間的基因組序列，利用Primer5軟件對(duì)查找到的系列進(jìn)行分析，尋找可以利用的微衛(wèi)星，設(shè)計(jì)合成新的SSR標(biāo)記。最后利用新發(fā)展的6對(duì)可用標(biāo)記擴(kuò)增RSL0152／0153的48株交換單株，繼續(xù)縮小兩個(gè)側(cè)翼標(biāo)記間的距離，這進(jìn)一步克隆該基因奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)然，為了證實(shí)該候選基因就是OEUI，還需要進(jìn)行遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步進(jìn)行OEUI基因的功能分析，研究赤霉素的合成代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及節(jié)間模式形成的分子機(jī)理。

一般而言，精細(xì)定位在圖位克隆中時(shí)一個(gè)限速步驟。隨著目標(biāo)染色體區(qū)域的逐漸縮小，尋找分子標(biāo)記的難度越來(lái)越大。因此，采取合適的方法來(lái)發(fā)掘多態(tài)標(biāo)記是非常重要的。在本研究中，我們嘗試了多種分子標(biāo)記技術(shù)，包括CAPS、SNP和SSR。相對(duì)而言，SSR比較適用，但數(shù)量較少，開發(fā)費(fèi)用較高。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，最有效的還是SSR。利用這種方法開發(fā)SSR標(biāo)記效率較高，費(fèi)用較低，適合于基因精細(xì)定位的需要。

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