張建芳，張水文，李建華，郭軍紅，徐 野

(北京軍區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 100700)

微小RNA(microRNA，miRNA)已經(jīng)成為近年來生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。miRNA對動(dòng)物生長、發(fā)育、成熟的時(shí)序調(diào)控、組織細(xì)胞的增殖、凋亡與分化以及人類疾病的發(fā)生中均發(fā)揮著重要作用。本文就miRNA在卵巢中的表達(dá)及可能的功能做一文獻(xiàn)綜述。

1 miRNA概述

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的RNA分子，約含有19～25個(gè)核苷酸(3’端可有1～2個(gè)堿基長度的變化)。lin-4是Lee等［1］在研究秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的發(fā)育中最早發(fā)現(xiàn)的小分子，它能夠通過與其3’UTR結(jié)合，調(diào)控線蟲細(xì)胞的時(shí)序發(fā)育。隨后，在線蟲(C．elegans和C．briggsae)、果蠅(Drosophila melanogaster)、斑馬魚(Danio rerio)、HeLa 細(xì)胞、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)及人類等多種真核生物中克隆出了上百種類似lin-4的小分子 RNA［2－4］，命名為微小 RNA(microRNA，miRNA)。

miRNA有其自身的生物學(xué)生特性，研究發(fā)現(xiàn)大約50%的miRNA基因彼此相鄰、排列成簇，帶有自己獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子［5］;其次，從低等的線蟲到人類，miRNA在進(jìn)化上呈非常顯著的保守趨勢，let-7是最具有保守性的miRNA，miRNA的這一特征為生物的進(jìn)化提供了有力的證據(jù)［3］;此外，miRNA的表達(dá)具有時(shí)序性和組織特異性，細(xì)胞和組織特異性以及表達(dá)水平的顯著變化，都提示我們miRNA可能參與了發(fā)育過程的調(diào)控，在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。

2 miRNA生物合成及其作用機(jī)制

目前，對于動(dòng)物(尤其是人類)miRNA的生物合成過程已經(jīng)初步得到了詮釋。首先，miRNA基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)在細(xì)胞核中被RNaseⅢDrosha 切割成前體 miRNA(pre-miRNA)［6，7］，在最初的剪切后，pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exportin-5的作用下由核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，然后由另一種RNase IIIDicer進(jìn)一步切割產(chǎn)生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與其他蛋白質(zhì)一起組成RISC(RNA-induced silencing complex)復(fù)合體，從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制［8］，miRNA生物合成過程如圖1所示。

miRNA對基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控通過翻譯促進(jìn)、翻譯抑制和mRNA的降解這三種作用方式實(shí)現(xiàn)，多種生理功能(如細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及代謝等)均受到miRNA對基因調(diào)控的影響。降解途徑主要發(fā)生在植物中，miRNA在動(dòng)物中則主要通過翻譯抑制實(shí)現(xiàn)［9］。Vasudevan等的研究結(jié)果顯示，腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNFα)受 miR-369-3的調(diào)控促進(jìn)作用是通過翻譯抑制而實(shí)現(xiàn)的［10］。

圖1 miRNA的生物合成［11］

3 miRNA在卵巢中的表達(dá)與功能

3.1 miRNA在卵巢中的表達(dá)

哺乳動(dòng)物卵巢最重要的功能是卵母細(xì)胞發(fā)育和排卵。在卵巢中，顆粒細(xì)胞是產(chǎn)生雌激素的主要部位并將內(nèi)分泌信號傳輸?shù)较鄳?yīng)靶器官。卵巢體細(xì)胞為卵母細(xì)胞生長和發(fā)育提供支持和營養(yǎng)，顆粒細(xì)胞分泌LH，在LH峰到來時(shí)引起排卵。這些響應(yīng)包括卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、類固醇激素合成、卵泡發(fā)育、卵丘擴(kuò)展、顆粒細(xì)胞黃體化和產(chǎn)生孕激素，最終促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟［12，13］。

卵巢上miRNAs通過RNase分解酶III的作用，使pre-miRNA轉(zhuǎn)化為成熟miRNA參與卵巢功能的調(diào)控。目前，利用Dicer敲除模型可進(jìn)行miRNA在小鼠卵巢的功能研究。Dicer－/－導(dǎo)致卵巢卵子發(fā)生、卵母細(xì)胞成熟、排卵和不育等生殖障礙［14，15］。關(guān)于miRNAs在卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟中的功能仍不十分清楚。然而，有研究表明卵巢中miRNAs通過作用于顆粒細(xì)胞發(fā)揮功能將在后面章節(jié)中詳細(xì)介紹。表達(dá)于小鼠卵巢的 miRNA有上百種，特定miRNA的功能及其靶基因還有待進(jìn)一步研究。

目前，利用基因芯片和克隆技術(shù)，檢測了卵巢中miRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，在成年小鼠卵巢中表達(dá)122種miRNAs，而在新生小鼠卵巢中表達(dá)的miRNA有177種(進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其中4種miRNAs在 Nobox－/－卵巢中顯著下調(diào)［16－18］。對小鼠顆粒細(xì)胞中miRNAs檢測結(jié)果表明，經(jīng)過hCG刺激后有3種miRNA顯著上調(diào)，以miR-132和miR-212上調(diào)最為顯著，同時(shí)有10種miRNA顯著下調(diào)，將體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞用環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cAMP同樣可促進(jìn)miR-132和miR-212的表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示，在顆粒細(xì)胞中miR-132和miR-212通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式調(diào)控可與類固醇激素生成因子(steroidogenic factor 1，SF-1)相互作用的轉(zhuǎn)錄抑制子C-末端結(jié)合蛋白1(C-terminal binding protein1，CtBP1)蛋白水平的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控類固醇激素的合成和分泌［19］。在豬卵巢中，共檢測到58種miRNA，miR-31和miR-92在豬卵巢中呈高表達(dá)［16］。

在敲除動(dòng)物模型中，利用經(jīng)典的AMH II型受體啟動(dòng)子Cre(Amhr2Cre+)特異性敲除雌性生殖系統(tǒng)中的Dicer1，產(chǎn)生的Dicer1f1/f1;Amhr2Cre+雌鼠不育，而雄性小鼠具有正常的生育能力。而在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，Dicer1f1/f1;Amhr2Cre+雌鼠具有正常的交配能力，且具有正常的發(fā)情周期，卵子也可以正常受精，只是排卵率明顯下降。所以單純卵巢特異性敲除Dicer1并不能引起不育，Dicer1f1/f1;Amhr2Cre+雌鼠不育的主要原因可能與其輸卵管的表型變化有關(guān)［20］。

3．2 miRNA與生殖細(xì)胞和胚胎性腺發(fā)育

胚胎性腺發(fā)育是許多基因精密調(diào)控的結(jié)果，在性腺發(fā)育中miRNA可能通過參與調(diào)控某些基因的表達(dá)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。Katsuhiko等［21］在9．5～13．5 dpc胚胎原始生殖細(xì)胞中，檢測到 4種miRNA表達(dá)下調(diào)，包括 miR-141，－200a，－200c和－323，miR-141和－200c都編碼于小鼠6號染色體(～2000 kb)中包含 Nanog，Stella/PGC7/Dppa3和Gdf3的片段，而且在人和小鼠中，miR-141和－200c的序列完全匹配，提示二者可能來源于相同的前體RNA(pri-RNA)，而且在小鼠和人的生殖細(xì)胞發(fā)育中具有相似的功能［22］。在11．5 ～13．5 dpc 胚胎性腺中，let-7家族成員let-7a，d，e，f和g在11．5 dpc性腺中表達(dá)上升，13．5 dpc時(shí)表達(dá)量最高，而這種上調(diào)作用僅在雄性原始生殖細(xì)胞中出現(xiàn)，這一結(jié)果提示miRNAs與原始生殖細(xì)胞中性別分化過程相關(guān)，而從13．5 dpc到出生前后的雄性生殖細(xì)胞中，miR-17-92維持高的表達(dá)水平，提示miR-17-92可能參與了雄性生殖細(xì)胞的進(jìn)一步增殖［23］。

另外，miR-17-92家族成員(除了miR-17-3p外)均可在生殖細(xì)胞中檢測到，且呈高表達(dá)，而這種高的表達(dá)水平在生殖細(xì)胞發(fā)育中一直持續(xù)，表明miR-17-92家族可能與原始生殖細(xì)胞增殖有關(guān)密切的關(guān)系。此外，miR-17-92對哺乳動(dòng)物癌癥細(xì)胞具有普遍的促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活的作用［24］。

在雞胚中，miR-202參與雞胚性別決定，而且miR-202*與雞胚性腺分化為睪丸具有密切的相關(guān)性。體內(nèi)注射17-β雌二醇導(dǎo)致雌性雄性化以及雄性性腺中miR-202*表達(dá)降低到與雌性相似的表達(dá)水平。雌激素合成阻斷后，雌性性腺雄性化，這與miR-202*表達(dá)增加和下調(diào)卵巢FOXL2基因表達(dá)以及上調(diào)睪丸相關(guān)基因SRY和SOX9表達(dá)相關(guān)［25］。

我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-143參與小鼠原始卵泡的形成過程，通過抑制前顆粒細(xì)胞增殖和調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的［26］。

目前，關(guān)于miRNAs在卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中的功能及其合成途徑仍不十分清楚。有研究顯示Dicer－/－導(dǎo)致卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟以及排卵等 生 殖 障 礙［14，15，27］。miRNA 合 成 特 有 的 酶DGCR8敲除能特異性阻斷miRNA作用通路［28］，而定向敲除卵母細(xì)胞中的DGCR8，卵母細(xì)胞成熟不受影響［29］。對牛卵母細(xì)胞研究顯示NOBOX是miR-196a潛在的靶基因，在牛早期胚胎發(fā)育中，miR-196a調(diào)控內(nèi)源性NOBOX的表達(dá)，此時(shí)miRNAs不僅抑制轉(zhuǎn)錄，而且還可能誘導(dǎo)了目標(biāo) mRNA的清除［30］。

3．3 miRNA與顆粒細(xì)胞功能及卵巢激素調(diào)控

Yao等研究結(jié)果顯示miR-224通過促進(jìn)cyp19a1基因表達(dá)促進(jìn)小鼠腔前卵泡顆粒細(xì)胞17β-雌二醇的分泌，對孕酮分泌沒有顯著影響，進(jìn)一步研究顯示，miR-224通過介導(dǎo)TGF-b1/Smad4信號通路調(diào)控小鼠顆粒細(xì)胞增殖［31］。此外，在研究miRNAs影響人卵巢細(xì)胞性腺類固醇激素分泌中，特異性抑制孕酮、睪酮和雌二醇的作用的miRNA分別為36、51和57種，而特異性促進(jìn)孕酮和雌二醇的分泌的miRNA分別為10和1種，結(jié)果表明具有抑制性腺類固醇激素分泌的miRNA占多數(shù)［32］;其中miR-378通過下調(diào)顆粒細(xì)胞芳香化酶活性抑制雌激素合成［33］。

顆粒細(xì)胞中LH誘導(dǎo)排卵和黃體化。研究結(jié)果表明，小鼠在注射hCG/LH 4 h后，顆粒細(xì)胞中顯著上調(diào)的 miRNA有14種，其中 miR-132、miR-212和miR-21表達(dá)量上升最為明顯，進(jìn)一步研究顯示，當(dāng)miR-21的表達(dá)下降到基礎(chǔ)水平的2/7時(shí)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡［34］，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miR-21具有抑制顆粒細(xì)胞凋亡的功能。Ma等［35］研究表明miR-378在黃體顆粒細(xì)胞凋亡中通過靶基因γ-干擾素受體1(interferon gamma receptor 1，IFNGR1)發(fā)揮抑制功能。

在哺乳動(dòng)物卵巢中，卵巢顆粒細(xì)胞在雌激素和孕激素分泌中發(fā)揮重要作用，而雌激素和孕酮的周期性變化對于正常雌性生殖活動(dòng)的維持是必需的，目前研究結(jié)果顯示，性腺激素與miRNA的相互作用對于卵巢功能的維持發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［36］。

關(guān)于激素與miRNA之間的關(guān)系，LH/hCG調(diào)控miRNAs的表達(dá)是近年來普遍認(rèn)可的觀點(diǎn)，LH/hCG可上調(diào)卵巢顆粒細(xì)胞中miR-132和miR-212的表達(dá)，miR-132是通過靶基因C-terminal結(jié)合蛋白(C-terminal binding protein 1，CTBP1)在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控顆粒細(xì)胞的功能。在卵巢中，follicle stimulating hormone(FSH)卵子發(fā)生中不僅促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和分化［37］，而且促進(jìn)腔前卵泡發(fā)育為排卵前卵泡，在顆粒細(xì)胞中，F(xiàn)SH可上調(diào)17種miRNA的表達(dá)，被FSH下調(diào)的miRNA有14種，同時(shí)FSH可促進(jìn)顆粒細(xì)胞孕激素的分泌。miR17-5p和let-7b缺乏可導(dǎo)致小鼠黃體化不足和不孕，這種效應(yīng)可通過卵巢注射內(nèi)miR17-5p和let7b被逆轉(zhuǎn)，表明miRNAs在黃體形成和功能維持中發(fā)揮重要作用［38］。

最近研究表明，許多miRNA參與人卵巢細(xì)胞的類固醇激素合成，其中有19種miRNAs對孕激素、雄激素和雌激素合成起抑制作用(miR-108、miR-135、miR-146、miR-19a、miR-20、miR-27、miR-28、miR-29、miR-125b、miR-126、 miR-137、miR-184、miR-31、miR-105、miR-128、miR-129、miR-132、miR-140和miR-188)，推測這些miRNA對內(nèi)分泌器官活性發(fā)揮生理抑制功能;有7種miRNA促進(jìn)孕酮分泌(miR-18、miR-24、miR-25、miR-32、miR-122、miR-125和miR-182)［36］。Kuokkanen 等通過對子宮 miRNA的研究結(jié)果顯示，在分泌期子宮中表達(dá)上調(diào)的12種miRNAs包括 miR-29b/c、miR-30b/d、miR-31、miR-193a-3p、 miR-203、miR-204、miR-200c、miR-210、miR-345和miR-582-5p，而在分泌期子宮中，孕酮是重要的促進(jìn)因子，此時(shí)被上調(diào)的miRNAs的靶基因預(yù)測結(jié)果顯示大多是參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的一些蛋白，如 cyclins、Cdks和/或轉(zhuǎn)錄因子 E2F3 等［31］。

3．4 miRNA與卵巢病理

近年來，通過對腫瘤中miRNA的研究結(jié)果顯示，miRNAs可能作為某些特定腫瘤組織的生物學(xué)標(biāo)記物，在許多病理診斷中提供有用的檢測手段。在卵巢中，Iorio等［39］通過對腫瘤組織和正常組織比較分析，結(jié)果顯示miRNA在卵巢上皮組織中表達(dá)差異，其中，卵巢癌組織中過表達(dá)的miRNA包括miR-200a、miR-141、miR-200c 和 miR-200b，而明顯下調(diào)的有 miR-199a、miR-140、miR-145 和 miR-125b1。卵巢功能早衰(premature ovarian failure，POF)組織中，miR-202、miR-146a、miR-125b-2* 、miR-139-3p、miR-654-5p、miR-27a、miR-765、miR-23a、miR-342-3p和miR-126過表達(dá)，而let-7c和miR-144表達(dá)低于正常組織［40］。

4 展望

目前對miRNA的研究還遠(yuǎn)不夠深入，許多奧秘有待探索。隨著研究的不斷展開和深入，對于卵巢中表達(dá)的miRNA，如何參與卵巢功能調(diào)控，以及調(diào)控靶基因預(yù)測，以及利用多種分析手段研究miRNA與卵巢疾病之間的關(guān)系，為miRNA在干預(yù)生殖與發(fā)育調(diào)節(jié)、治療生殖相關(guān)疾病、輔助生殖等領(lǐng)域提供新策略，也為不孕不育患者帶來新的希望。

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