王榮亮，趙海蘋(píng)，羅 玫，張 營(yíng)，陶 真，閆 峰，羅玉敏

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，腦血管病研究室，北京 100053)

腦血管病因其高致殘率和高致死率而成為危害人類(lèi)健康的三大疾病之一。目前，關(guān)于腦缺血再灌注損傷機(jī)制的研究越來(lái)越關(guān)注腦組織缺血后的炎癥反應(yīng)。大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，腦缺血后級(jí)聯(lián)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷的重要原因［1，2］，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，多種因素相互作用，共同引起再灌注損傷。通過(guò)藥物及外界手段抑制腦缺血再灌注過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，減輕腦組織損傷，可能為防治腦缺血疾病提供一條新的有效途徑［3］。然而，對(duì)于急性缺血性腦血管病患者，目前除了早期溶栓治療外，幾乎沒(méi)有其他有效的治療方法。遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)(RIPostC)是近些年來(lái)發(fā)展的一種干預(yù)措施，它是在重要生命器官發(fā)生缺血后，通過(guò)對(duì)遠(yuǎn)程器官重復(fù)給予幾次短暫的、非致死性的缺血和再通，可以明顯減輕再灌注損傷。RIPostC可通過(guò)實(shí)施于非生命重要器官來(lái)保護(hù)某些對(duì)缺氧缺血極其敏感的生命重要器官(比如腦組織)，并且可以在缺血事件發(fā)生之后進(jìn)行，因此具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。已有研究表明，遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)對(duì)腦損傷有保護(hù)作用，而且實(shí)施的越早，效果可能越好［4］。

缺血再灌注損傷時(shí)促炎細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)會(huì)迅速上調(diào)［5－8］，其中單核細(xì)胞化學(xué)趨化蛋白-l(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(macrophage inflammatory protein，MIP-1α)在腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)的重要作用已引起廣泛關(guān)注［5，6］。MIP-1α是屬于CC亞族的一種趨化性細(xì)胞因子，主要由單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，趨化單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等。近來(lái)有不少研究表明，MIP-1α在缺血性腦血管病的再灌注損傷中發(fā)揮非常重要的作用［9－12］。MCP-1、MIP-lα 與抗體結(jié)合后可促進(jìn)白細(xì)胞遷移，應(yīng)用受體拮抗劑后，可減少腦梗死體積［10］。Terao 等［13］的研究表明，在腦缺血后 MIP-3α顯著增加，腦室注射MIP-3α中和抗體后，可顯著減小缺血后腦組織的損傷。這些研究提示，巨噬細(xì)胞炎性蛋白可在腦缺血后增加腦組織的損傷，而抑制其表達(dá)可使損傷減少。因此，MIP-1α在腦缺血引發(fā)的炎癥反應(yīng)中起到非常重要的樞紐作用，可以成為治療腦缺血的一個(gè)新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠77只，體重(280～310)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2008-0001)。恒溫條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前一晚禁食但不禁水。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分為7組:(1)假手術(shù)組(S，n=11);(2)缺血再灌注 8 h組(I8，n=11);(3)缺血后適應(yīng)8 h組(R8，n=11);(4)缺血再灌注24 h組(I24，n=11);(5)缺血后適應(yīng)24 h組(R24，n=11);(6)缺血再灌注72 h組(I72，n=11);(7)缺血后適應(yīng)72 h組(R72，n=11)。

1.2 主要試劑與儀器

小動(dòng)物呼吸機(jī)(Harvard Apparatus 683)、雙極電凝(Devel，ACC100)、顯微鏡(Carl Zeiss)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(Harvard Apparatus)、血?dú)夥治鰞x(Abbott，i-STAT)、有創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)儀(Siemens SC600C)、顯微手術(shù)器械、生物安全柜(Labconco Class II Type A2)、PCR儀(MJ Research)、電子天平(Adventurer)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(Scientz-IID)、離心機(jī)(Thermo)、酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，Thermo)、MIP-1α 抗體(Santa Cruz Biotechnology，sc-33203)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(北京中杉金橋生物科技公司)、ECL發(fā)光液(Millipore)、NC 膜 (Pall)、化 學(xué) 發(fā) 光 儀(ChemiScope)、免疫熒光顯微鏡(Nikon digital imaging hero eclipse 80i)、搖床(TS-1/TS-8)。

1.3 動(dòng)物模型的制備

大鼠稱(chēng)重后用4%恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，應(yīng)用小動(dòng)物呼吸機(jī)及麻醉機(jī)，1% ～2%恩氟烷混合70%N2O和30%O2維持麻醉，術(shù)中監(jiān)測(cè)肛溫、血糖、血?dú)饧把獕?，各?xiàng)指標(biāo)維持在正常范圍。選擇右側(cè)大腦中動(dòng)脈，所應(yīng)用的線栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司)頭部直徑為0.38 mm，將其插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至距頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分叉處約1.8 cm～1.9 cm。栓塞2 h后拔出栓子制備缺血2 h再灌注損傷模型，分別于再灌注后8 h、24 h和72 h處死大鼠，斷頭取腦，以備石蠟切片制作以及腦組織蛋白的提取用。假手術(shù)組做鈍性分離，插入線栓后立即拔出，腦組織無(wú)缺血損傷。

1.4 遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)方法

如之前所述，有研究表明:遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)實(shí)施的越早，對(duì)腦保護(hù)的效果可能越好［4］。我們之前已研究過(guò)缺血2 h后給予后適應(yīng)所起到的神經(jīng)保護(hù)作用［14］，為了具體研究其作用機(jī)制，我們采取缺血即刻后適應(yīng)，方法如下:分離大鼠雙側(cè)股動(dòng)脈主干，在大鼠腦缺血即刻夾閉雙側(cè)股動(dòng)脈10 min，放開(kāi)10 min，如此共進(jìn)行3個(gè)循環(huán)。

1.5 石蠟切片的制備

將假手術(shù)組(n=4)和實(shí)驗(yàn)組8 h(n=4)、24 h(n=4)和72 h(n=4)分別于再灌注后8 h、24 h和72 h后用10%水合氯醛腹腔麻醉，右心房快速灌注肝素化PBS及4%多聚甲醛進(jìn)行固定，斷頭取腦，除去嗅球和小腦，置4%多聚甲醛中后固定48 h后放入模具，于視交叉處沿冠狀切片，向前囟方向切2張切片，向小腦方向切3張切片，每片厚約2 mm，石蠟包埋。

1.6 熒光定量RT-PCR檢測(cè)

首先進(jìn)行總RNA提取，冰上分離大鼠皮層，加入含一定量TRIzol的研磨器中，反復(fù)研磨勻漿。室溫放置5 min后，每1 mL TRIzol中加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。12 000 r/min 4℃離心15 min，將上層的水相吸至新的離心管內(nèi)，加入0.5 mL的異丙醇，室溫放置10 min，于4℃ 以小于12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。棄去上清液，用1 mL 75% 的乙醇清洗沉淀，于4℃ 以7 500 g轉(zhuǎn)速離心5 min，用微量移液器盡可能將乙醇吸盡，隨后于室溫放置5～10 min，使殘留乙醇揮發(fā)干凈。用DEPC處理的去離子蒸餾水20 μL溶解沉淀，測(cè)A260、A280值，計(jì)算A260/A280比值，估算樣品中RNA的含量和純度。用DEPC處理的去離子蒸餾水調(diào)整樣品終濃度為 1 μg/μL，置于 －80℃ 冰箱保存。

cDNA的合成:將以下成份加入經(jīng)DEPC處理的200 μL EP 管內(nèi)。(500 μmol/L 隨機(jī)引物 1 μL;10 μm dNTP 2 μL;1 μg/μL 細(xì)胞總 RNA 2 μL;用DEPC處理的去離子蒸餾水補(bǔ)至12 μL。65℃變性5 min后即刻冰浴，加入5×first chain緩沖液4 μL、0.1 M DTT 2 μL、40 U/μL RNase 抑制劑 1 μL，混勻。37℃加熱5 min。加10 U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 1 μL，混勻，37℃加熱 50 min。70℃滅活 15 min，反應(yīng)物保存于－20℃冰箱備用。熒光定量PCR檢測(cè)MIP-1α合成的引物:正向 5'-GCGCTCTGGAA CGAAGT-3'，反向 5'-GCAAAGGCTGCTGGTCT-3'。

PCR 反應(yīng)條件:a．反應(yīng)體系為 25 μL，其中MIP-1α選用2×GC II緩沖液，GAPDH選用10×緩沖液:2 ×GC II緩沖液12.5 μL、10 mM dNTP 2 μL、20 μM 引物:SN 0.5 μL、ASN 0.5 μL、cDNA(1 μg/μL)1 μL、Taq 酶 1.25 μL、加雙蒸水至 25 μL、10 ×緩沖液:10 mM dNTP 2 μL、20 μM 引物:SN 0.5 μL、ASN 0.5 μL、cDNA(1 μg/μL)1 μL、Taq 酶 1.25 μL、加雙蒸水至25 μL。b．?dāng)U增反應(yīng)條件:①預(yù)變性:95℃ 5 min。②變性:95℃ 30 s;退火:MIP-1α 55℃ 30 s，GAPDH 54℃ 30 s;延伸:72℃ 1 min。③循環(huán)數(shù):最佳退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)因擴(kuò)增的目的基因片段而異。分別于第20、22、24…38、40個(gè)循環(huán)各取出一管反應(yīng)產(chǎn)物，取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)目的帶光密度掃描定量，以光密度值-循環(huán)數(shù)作曲線，選擇PCR反應(yīng)達(dá)平臺(tái)期前的指數(shù)增長(zhǎng)期循環(huán)數(shù)確定為半定量PCR的反應(yīng)循環(huán)數(shù)。MIP-1α循環(huán)數(shù)為32，GAPDH循環(huán)數(shù)為26。④72℃延伸30 s，72℃延伸1 min。⑤4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳:制備1%瓊脂糖凝膠，EB染色。凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入恰好沒(méi)過(guò)膠面約1 mm深的足量1×TBE電泳緩沖液。吸取DNA樣品各5 μL與所需加樣緩沖液(loading buffer)混合，用一次性微量移液器，慢慢將混合物加至樣品槽中。蓋上電泳槽并通電，使DNA向陽(yáng)極移動(dòng)。100 V穩(wěn)壓電流電泳20 min左右。切斷電源，從電泳槽上拔下電線，打開(kāi)槽蓋。在紫外燈下自顯影并照相。應(yīng)用GEL-PRO analyzer 2.0分析軟件對(duì)各目的條帶的光密度值(A)進(jìn)行分析，計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)水平(相對(duì)表達(dá)水平=A目的基因/A內(nèi)對(duì)照基因)。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)

將假手術(shù)組(n=4)、缺血再灌注組和缺血后適應(yīng)組8 h(n=4)、24 h(n=4)、72 h(n=4)分別于再灌注后8 h、24 h和72 h處死大鼠，取梗死側(cè)皮層腦組織置于冰上，稱(chēng)重后加入5倍的裂解液，將樣品用小剪刀剪碎，在冰水浴中用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行勻漿后，冰浴 30 min，12 000 r/min 4℃離心 30 min，取上清液。在酶標(biāo)儀上用BCA法參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，于560 nm處測(cè)定樣本的吸光度值(A值)。根據(jù)蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本的蛋白含量。

配制15%分離膠和5%積層膠，取180 μg蛋白樣品溶于相應(yīng)體積的上樣液中，水浴鍋98℃加熱5 min，蛋白變性后即刻加樣。室溫下40 V電泳1 h，蛋白樣品到達(dá)分離膠后將電壓調(diào)為80 V，繼續(xù)電泳約1.5 h。配制電轉(zhuǎn)液，冰浴中60 V 30 min電轉(zhuǎn)。將電轉(zhuǎn)后的NC膜置于TBST中清洗3次，每次5 min，置入8%脫脂牛奶中4℃封閉過(guò)夜。第2天將膜置入一抗中室溫孵育4 h，隨后TBST清洗3次，每次5 min，再置入二抗中室溫孵育1 h?？贵w如下稀釋:抗 MIP-1α(1∶200)、抗 actin(1∶2 000)、HRP標(biāo)記山羊抗兔(1∶2 000)。與二抗反應(yīng)好后，將膜置于ECL發(fā)光液中3 min，放入化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。得到的結(jié)果用Quantity one 4.4.0軟件分析蛋白條帶的相對(duì)灰度。

1.8 免疫熒光染色

依次進(jìn)行腦組織切片的二甲苯脫蠟、梯度酒精入水，0.3%的H2O2/甲醇溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，EDTA抗原微波熱修復(fù)12 min，小牛血清封閉非特異性抗原，4℃過(guò)夜;加1∶200稀釋的MIP-1α抗體，室溫2 h;1×PBS(pH=7.4)漂洗3次，每次3 min;加TRITC山羊抗兔IgG，室溫孵育30 min;1×PBS(pH=7.4)漂洗3次，每次3 min;DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示，各數(shù)據(jù)組間比較使用one-way ANOVA方法，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血 MIP-1α mRNA含量的影響

圖1和圖2分別為熒光定量RT-PCR檢測(cè)的大鼠腦缺血核心區(qū)和半暗帶區(qū)MIP-1α mRNA表達(dá)的結(jié)果。從圖1中可見(jiàn)，在缺血核心區(qū)，單純?nèi)毖MMIP-1α mRNA的表達(dá)缺血再灌注組高于S組，8 h達(dá)高峰，24 h時(shí)之后持續(xù)下降。缺血后適應(yīng)組MIP-1α mRNA的表達(dá)變化趨勢(shì)與缺血再灌注組相同。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，其中I8組與S組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，R8組和R24組與S組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

從圖2中可見(jiàn)，在缺血半暗帶區(qū)域，MIP-1α mRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)與缺血核心區(qū)相似，其中I8組與S組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而其他組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 大鼠腦缺血梗死核心區(qū)MIP-1α mRNA表達(dá)水平(s)Fig．1 The mRNA level of MIP-1α expression in the cerebral ischemic core(±s)

2.2 遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血皮層區(qū)MIP-1α蛋白含量的影響

圖3為免疫印跡法檢測(cè)的大鼠MIP-1α蛋白表達(dá)結(jié)果和統(tǒng)計(jì)圖。與S組相比，隨著缺血再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，I組及R組MIP-1α蛋白的表達(dá)均有所增加，其中I24 h和I72 h顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。與I組相比，R24 h和 R72h組MIP-1α的表達(dá)下降，與I 72 h相比，R72 h組MIP-1α的表達(dá)下降顯著，接近于 S組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。其余各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 免疫熒光結(jié)果

圖2大鼠腦缺血半暗帶區(qū)MIP-1α mRNA表達(dá)水平ˉ±s)Note:Sham;I/R:MCAO model;I/R+R:MCAO+RIPostC．Fig．2 MIP-1α mRNA level in the cerebral ischemic penumbra±s)

圖3大鼠腦缺血皮層區(qū)MIP-1α蛋白的表達(dá)水平±s)Fig．3 MIP-1α protein level in the cerebral ischemic cortex

圖4(見(jiàn)文后彩插1)為大鼠腦組織在缺血72 h后皮層區(qū)MIP-1α的免疫熒光染色結(jié)果圖。缺血再灌注72 h后，I72 h組MIP-1α的表達(dá)水平顯著增加;相比較而言，給予遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)干預(yù)的R72 h組表達(dá)降低，接近sham組水平。免疫熒光的結(jié)果與Western blot的結(jié)果相符。

3 討論

本文主要是探討遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠腦組織MIP-1α mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響，為遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。本研究表明，與S組相比，缺血模型組及遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)組MIP-1α mRNA均有不同程度地升高，均在缺血再灌注后8 h時(shí)達(dá)到峰值，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Schmidt-Kastner R 等［7］發(fā)現(xiàn)，在大鼠短暫缺血3 h后，MIP-1α mRNA 水平即開(kāi)始升高。Sieber等［15］和 Nishi等［6］在用小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，MIP-1α mRNA在缺血再灌注后6～12 h顯著增加，12 h達(dá)到最高值。這與本研究的缺血再灌注組(I組)結(jié)果相符，梗死核心區(qū)及缺血半暗帶MIP-1α mRNA的水平均在缺血8 h后達(dá)到最高，隨后開(kāi)始下降。結(jié)果表明，遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)不能降低缺血核心區(qū)的MIP-1α mRNA表達(dá)水平，在缺血半暗帶可一定程度上降低MIP-1α mRNA水平，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，在本研究中，MIP-1α蛋白在缺血再灌注24 h后達(dá)到高峰，這與Nishi等［6］的研究結(jié)果相符。缺血后各組的MIP-1α蛋白表達(dá)均有所增加，與 S組相比，缺血模型組MIP-1α在缺血再灌注24 h和72 h后顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;值得注意的是，在缺血再灌注72 h組中，相對(duì)缺血模型組，遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)組MIP-1α表達(dá)水平顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果提示MIP-1α參與了大鼠腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)，而遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)可能通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腦保護(hù)作用，這在再灌注損傷的晚期較為明顯。但由于實(shí)驗(yàn)沒(méi)有涉及到72 h后的時(shí)間點(diǎn)，無(wú)法驗(yàn)證RIPostC在腦缺血再灌注后更長(zhǎng)時(shí)間的保護(hù)作用，這也是本研究的不足之處。

之前已有研究表明，肢端缺血預(yù)處理(limb ischemic preconditioning，LIP)可抑制炎癥因子的表達(dá)，減輕腦缺血后炎癥反應(yīng)，從而對(duì)腦組織起到保護(hù)作用［16］。本研究采用的是遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)是在缺血后采取的干預(yù)，因此，擁有更好的臨床應(yīng)用前景。進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用而拮抗其致炎效應(yīng)，可能是今后防治腦缺血的一條新的有效途徑。

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