王維益，劉建博，郭 敏，蔡俊翔，雷 源

（1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州501405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州501405）

現(xiàn)代醫(yī)學認為，哮喘是由多種細胞包括氣道的炎性細胞和結(jié)構(gòu)細胞（如嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等）和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]，其原因是氣道發(fā)生了重構(gòu)[2]，其中支氣管平滑肌細胞（ASMC）增殖在氣道重構(gòu)中占有十分重要的地位。本實驗擬通過MTT法及流式細胞術(shù)檢測分析加減射麻止喘湯對哮喘大鼠ASMC 增殖的干預作用，為支氣管哮喘的進一步防治提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級SD 雄性大鼠，體質(zhì)量250～300 g，35 只，合格證號：0080764 0077574，許可證號：scxk(粵)2008-0020，廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

1.1.2 加減射麻止喘液湯方藥 射干，地龍，椒目，北杏仁，法半夏，桔梗，細辛，甘草，質(zhì)量比為1∶1.2∶1∶0.6∶1.2∶1.2∶0.6∶0.6，按傳統(tǒng)煎藥法制成含生藥為1.48 g/mL 的水劑。

1.1.3 試劑 注射用青霉素鈉（批號：Y1203411）、注射用硫酸鏈霉素（批號：1009104）購于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院；雞卵清蛋白（批號：9006-59-1）、氫氧化鋁(批號：21645-51-2)購于廣州齊云生物技術(shù)有限公司；PMA(批號：1626450)購于LClabs 公司；Ro-31-8220（批號：sc-200619）購于Santa Cruz 公司；核糖核酸酶（RNA 酶）（批號：182651301）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（批號：132613903）購于Sigma 公司；木瓜蛋白酶（批號：1626405）購于Merck 公司；膠原酶I型（批號：17100-017）購于Gibco 公司；DMEM 高糖培 養(yǎng) 液 （批號：GNM12800）、胰蛋白酶 (批號：SH30042.01)、PBS 緩沖液（批號：GNM200120）、胎牛血清(FBS)（批號：SV30087.01）購于Hyclone 公司；碘化丙啶(PI)（批號：95458）、二甲基亞砜（DMSO）(批號：196055)、牛血清白蛋白（BSA）（批號：021624104）購于廣州威佳科技有限公司。

1.1.4 主要儀器 402AI 超聲霧化器由江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司生產(chǎn)；Epics Altra 流式細胞儀由美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)；TDL-5 離心機由上海天本公司生產(chǎn)；LX70 倒置顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)；550 酶標儀由美國BIO-RAD 公司生產(chǎn)；SL 型CO2培養(yǎng)箱由美國Sheldon 公司生產(chǎn)；自制霧化箱 （35 cm×23 cm×21 cm，箱壁上有一大小約12 cm2可放入霧化管的孔）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將35 只大鼠分為空白組4 只，正常組5 只，模型組5 只，加減射麻止喘湯高、中、低劑量組各7 只。

1.2.2 哮喘大鼠模型建立[3]哮喘模型組大鼠5只，第1 天每只大鼠腹腔注射含10 mg 卵清蛋白和200 mg 氫氧化鋁的生理鹽水1.5 mL，第8 天重復致敏1 次，第15 天開始激發(fā)，將大鼠置于自制霧化箱內(nèi)，用超聲霧化器噴入含20 mg/mL 卵清蛋白的生理鹽水，激發(fā)30 min，1 次/d，激發(fā)后大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸加快等哮喘發(fā)作癥狀，共激發(fā)15 d。正常組大鼠5 只，不予藥物致敏及霧化。

1.2.3 含藥血清制備 將21 只大鼠隨機分為高、中、低加減射麻止喘湯給藥劑量組（分別予含生藥14.8 g/kg、7.4 g/kg、1.48 g/kg 的加減射麻止喘湯），每天灌胃1 次，連續(xù)7 d?？瞻捉M大鼠4 只，不予藥物灌胃。7 d 后各組大鼠分別眼眶靜脈采血，離心血清 （3 000 r/min，37 ℃，20 min），56 ℃、30 min 滅活，-20 ℃冷藏備用。

1.2.4 哮喘模型組大鼠支氣管平滑肌的病理鏡檢及ASMC 的提取與傳代培養(yǎng) 哮喘模型組大鼠造模成功后最后一次激發(fā)后24 h 內(nèi)，脫頸處死大鼠并浸泡酒精后取出，分離出支氣管，提取少量支氣管同正常對照組大鼠支氣管行鏡檢（HE 染色），觀察病理特點提示哮喘大鼠造模成功（見圖1～2）。哮喘模型組大鼠其余支氣管置入PBS 液中，用眼科剪剔除肺組織、內(nèi)外膜及結(jié)締組織等，直至支氣管接近透明。將獲得的支氣管平滑肌組織盡量剪碎，置于含1 mg/mL 膠原酶I 型、1 mg/mL 木瓜蛋白酶、10 mg/mL BSA 的PBS液中，37 ℃消化約20 min 后，室溫800 r/min 離心5 min，棄上清液后高糖培養(yǎng)液（DMEM）洗滌2 次，細胞篩篩去組織，用含20% FBS、100 U/mL 青霉素鈉、100 U/mL 硫酸鏈霉素的DMEM 懸浮所分離的細胞，種植于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 換液1 次，約14 d 細胞貼壁生長90%融合后傳代培養(yǎng)，實驗用3～5 代細胞。

圖1 哮喘模型組大支氣管平滑肌病理形態(tài)光鏡圖（HE ×200）

圖2 正常組大鼠支氣管平滑肌病理形態(tài)光鏡圖（HE ×100）

1.2.5 MTT 法檢測ASMC增殖培養(yǎng)的ASMC 按1×105個/孔接種于96 孔板，用高糖DMEM 液培養(yǎng)24 h，使細胞同步于G0期后，分別予加減射麻止喘湯高、中、低劑量含藥血清、空白組大鼠血清、蛋白激酶C 激活劑佛波醇-12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯PMA (10 nmol/L) 及蛋白激酶C 抑制劑馬來酰亞胺甲磺酸鹽Ro-31-8220(5 μmol/L)干預，各組設6 個復孔，同時換用含體積分數(shù)10% FBS 的DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加5 mg/mL MTT 20 μL，4 h后去培養(yǎng)液，加DMSO 150 μL 搖勻，約10 min 后用酶標儀于450 nm 處測定各孔吸光度D 值。

1.2.6 流式細胞儀檢測ASMC 周期 傳代后的ASMC 按1×105個/mL 接種于6 孔板，細胞同步于G0期后分組，均予含10% FBS 的DMEM 液繼續(xù)培養(yǎng)，同時每 1 mL 細胞培養(yǎng)液中分別予 PMA(10 nmol/L)、Ro-31-8220(5 μmol/L)、含藥血清(加減射麻止喘湯高劑量組)及空白組大鼠血清干預，24 h后0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，PBS 配制濃度為1×105個/mL 細胞懸液，用預冷的75%乙醇固定，-4 ℃冰箱內(nèi)放置24 h，800 r/min 離心5 min 沉淀細胞，棄上清液，PBS 洗滌1 次，先后加入50 μg/mL RNA 酶和10 μg/mL PI 各0.5 mL，室溫避光放置30 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以±s 表示，多組間比較采用F 檢驗,兩兩之間比較采用q 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 加減射麻止喘湯各組大鼠ASMC D 值

哮喘模型組大鼠ASMC 中，PMA 組D 值較正常組顯著增加（P＜0.05)，Ro-31-8220 組的D 值較正常組顯著降低（P＜0.05)，加減射麻止喘湯高、中、低劑量組的D 值較正常組、PMA 組顯著降低（P＜0.05)；中劑量組的D 值和Ro-31-8220 組無顯著差異（P＞0.05)，高低劑量組的D 值較Ro-31-8220 組顯著增加 （P＜0.05)。見表1。

2.2 加減射麻止喘湯各組大鼠ASMC 各周期分布百分比

表1 加減射麻止喘湯對各組哮喘大鼠ASMC 的D 值的影響 （n=6，±s）

表1 加減射麻止喘湯對各組哮喘大鼠ASMC 的D 值的影響 （n=6，±s）

注：與正常組比較*P＜0.05；與PMA 組比較＃P＜0.05；與Ro-31-8220 組比較△P＞0.05，▲P＜0.05。

組 別 D 值PMA 組 0.952 2±0.045 8*▲Ro-31-8220 組 0.501 7±0.077 5*加減射麻止喘湯高劑量組 0.662 2±0.119 2*▲＃加減射麻止喘湯中劑量組 0.561 8±0.067 8*△＃加減射麻止喘湯低劑量組 0.686 8±0.201 0*▲＃正常組 0.810 5±0.054 8

哮喘模型組大鼠ASMC 中，PMA 組G1細胞百分比較正常組顯著降低，G2/M 期顯著增高（P＜0.05)，S 期無顯著差異（P＞0.05)；Ro-31-8220 組的G1期細胞百分比較正常組顯著升高，G2/M、S 期顯著降低（P＜0.05)；加減射麻止喘湯高劑量組的G1細胞百分比較空白組、PMA 組顯著升高，G2/M 期、S 期顯著降低（P＜0.05)；加減射麻止喘湯高劑量組的S 期與Ro-31-8220 組比較顯著升高（P＜0.05)，G2/M 期無顯著差異（P＞0.05)。見表2。

表2 流式細胞法檢測各藥物干預組哮喘大鼠ASMC 各周期分布百分比 （±s，n=6，%）

表2 流式細胞法檢測各藥物干預組哮喘大鼠ASMC 各周期分布百分比 （±s，n=6，%）

注：與正常組比較*P＜0.05，▲P＞0.05；與PMA 組比較＃P＜0.05；與Ro-31-8220 組比較△P＜0.05，□P＞0.05。

組 別 G1 S G2/M PMA 組 55.183 3±3.757 3* 11.366 7±3.338 7▲ 33.483 3±2.658 1*Ro-31-8220 組 94.700 0±0.613 7* 2.500 0±0.687 1* 2.783 3±0.402 1*加減射麻止喘湯高劑量組91.950 0±1.091 3*＃ 5.800 0±2.101 4*△＃ 2.250 0±1.350 2*□＃正常組 62.950 0±1.348 7 12.483 3±3.754 2 26.433 3±6.077 1

3 討論

支氣管哮喘屬中醫(yī)學“哮病”、“喘證”范疇，其發(fā)病與肺、脾、腎三臟有關(guān)，多因痰飲內(nèi)伏、風寒襲肺、痰濕壅阻、肺失宣降所致，故治療上多以化痰、平喘、宣肺、健脾、補腎等為主?！督饏T要略》記載“咳而上氣，喉中水雞聲，射干麻黃湯主之”，本研究中加減射麻止喘湯由射干麻黃湯加減化裁而成，具有宣肺平喘、祛痰止咳的功效。既往臨床與實驗室研究提示射麻止喘液能明顯改善哮喘患者肺功能，其機制可能與拮抗炎性介質(zhì)、降低氣道高反應性、降低血黏度［4］，降低血漿及肺組織ET 水平，抑制嗜酸性粒細胞的浸潤［5］，減少血漿cAMP 含量、增加cGMP 含量，松弛支氣管平滑肌［6］等作用有關(guān)。

蛋白激酶C（PKC）是一類Ca2+、磷脂依賴性的蛋白激酶，在跨膜信號傳遞過程中起著重要作用，PKC 信號途徑是與細胞增殖有關(guān)的一種信號轉(zhuǎn)導通路［7-8］。已有研究表明［8］在PKC 激動劑PMA 的刺激下，哮喘大鼠ASMC 細胞增殖水平明顯增高，而PKC 抑制劑Ro-31-8220 則能抑制細胞增殖。本實驗通過與PMA 組、Ro-31-8220 組、正常組哮喘大鼠ASMC 增殖情況比較，提示加減射麻止喘湯可影響哮喘大鼠平滑肌細胞的生長周期，抑制細胞增殖，從而影響氣道重構(gòu)，而加減射麻止喘湯抑制哮喘大鼠支氣管平滑肌細胞增殖的作用與藥物濃度的關(guān)系有待進一步研究與探討。

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