張 芳，韓 娜，蔡 晶，方 黎，張中冕

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450014

肺癌是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤。中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者占肺癌總數(shù)的75%～80%，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)；接受根治性手術(shù)的患者也多數(shù)因復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗，藥物治療仍是晚期非小細(xì)胞肺癌治療的重要手段之一[1-4]。新型藥物BEZ235是磷酸肌醇3(PI3K)和其下游因子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的雙重靶向抑制劑，已表現(xiàn)出良好的抑制多種實(shí)體瘤的作用[5-8]。該研究以人肺腺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察BEZ235對(duì)A549細(xì)胞增殖及akt、mek、erk mRNA表達(dá)水平的影響, 初步探討B(tài)EZ235在肺癌治療中的作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料BEZ235購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所，RPMI 1640培養(yǎng)液和2.5 g/L胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)和MTT購(gòu)自Sigma公司。A549細(xì)胞株由鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。akt、mek和erk擴(kuò)增引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組A549細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(內(nèi)含青霉素100 kU/L、鏈霉素100 mg/L)，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)。每1～2 d 傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組，對(duì)照組(僅含細(xì)胞和培養(yǎng)液而不含藥物)，BEZ235低、中、高劑量組(分別加入2.5、5和10 mol/L BEZ235)，培養(yǎng)24、48、72 h。

表1 akt、mek和erk擴(kuò)增引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，細(xì)胞密度約為5 000個(gè)/孔，置恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h后吸出原培養(yǎng)液，按照1.2中分組處理，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)中止前4 h，每孔加入20 μL 5 g/L 的MTT培養(yǎng)4 h 后，再加入150 μL DMSO，振蕩10 min。以空白對(duì)照孔調(diào)零，在492 nm 波長(zhǎng)處用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率 = (1-A實(shí)驗(yàn)/A陰性對(duì)照)×100%。

1.4akt、mek、erkmRNA的檢測(cè)采用RT-PCR。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，以1×105mL-1接種于6孔板，每孔2 mL，常規(guī)培養(yǎng)，12 h后完全貼壁，按照1.2中分組，作用48 h后終止。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后, 每孔加入1 mL Trizol，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸15 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳(120 V，18 min) 后，紫外透射儀下觀察并照相，以目的基因與內(nèi)參條帶亮度的比值代表mRNA的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用3×3析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同濃度BEZ235作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率的影響；采用單因素方差分析比較不同濃度BEZ235作用于A549細(xì)胞48 h后akt、 mek及erk mRNA表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1BEZ235對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響隨著B(niǎo)EZ235作用濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，A549細(xì)胞的增殖抑制率升高，呈濃度、時(shí)間依賴性。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞增殖抑制率比較(n=6) %

F組間=233.315，F(xiàn)時(shí)間=171.598,F交互=6.770，P均<0.001。

2.2BEZ235對(duì)A549細(xì)胞akt、mek、erkmRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示，各組均可檢測(cè)到akt、mek、erk mRNA的表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度BEZ235作用48 h后A549細(xì)胞akt、mek、erk mRNA的表達(dá)

隨著B(niǎo)EZ235濃度的增高，akt mRNA的表達(dá)水平下降，而mek、erk mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯改變，見(jiàn)表3。

3 討論

PI3K/Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK是兩條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移和凋亡中起關(guān)鍵作用，這兩條通路是抗腫瘤藥物治療的有效靶點(diǎn)，且PI3K/Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK信號(hào)通路間可能存在特異信號(hào)交流[9-11]，Akt 通過(guò)使Raf 磷酸化可有效抑制Raf 的活性，如果使用抑制劑抑制Akt的活性，則Raf/MEK/ERK通路的活性增強(qiáng)[12]。新型藥物BEZ235是PI3K和mTOR雙激酶抑制劑，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合酶的ATP結(jié)合槽，目前已進(jìn)入Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)。Xu 等[13]的研究表明BEZ235對(duì)于雷帕霉素耐藥的細(xì)胞具有很好的抑制作用；Engelman等[14]的研究表明BEZ235對(duì)存在k-ras突變的肺癌小鼠的抑瘤效果并不佳，當(dāng)聯(lián)合MEK抑制劑時(shí)抑瘤效果明顯好于單用BEZ235，二者聯(lián)合有顯著的協(xié)同抑瘤作用。

為了探討B(tài)EZ235作為PI3K/mTOR的雙重抑制劑在發(fā)揮其抑瘤作用時(shí)是否會(huì)對(duì)Raf/MEK/ERK通路產(chǎn)生影響，該研究以肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)MTT檢測(cè)不同濃度BEZ235處理后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，同時(shí)選擇在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用的PI3K/Akt/mTOR與Raf/MEK/ERK兩條通路上的關(guān)鍵分子akt、mek和erk, 通過(guò)RT-PCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，BEZ235能夠抑制A549細(xì)胞增殖，且抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性；RT-PCR結(jié)果顯示BEZ235可降低A549細(xì)胞akt mRNA的表達(dá)水平，但對(duì)mek、erk mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。

總之，該研究結(jié)果顯示，BEZ235能夠呈濃度和時(shí)間依賴性抑制A549細(xì)胞增殖，這種抑制作用可能與下調(diào)akt mRNA的表達(dá)有關(guān)。BEZ235在肺癌中的作用有待進(jìn)一步深入研究，從而為聯(lián)合用藥及臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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