王慶敏，時粉周，唐 瑛，劉秋紅，戴圣龍，李科華

近日節(jié)律又名晝夜節(jié)律，是一種周期約為24 h的節(jié)律，是隨著白天和黑夜的交替而發(fā)生變化,在生命活動中起著重要的作用[1- 4]。機體的多種生理活動都被該種節(jié)律調(diào)控，如睡眠與覺醒、血壓、體溫、心跳及激素水平等。相關(guān)研究提示哺乳動物的免疫系統(tǒng)也存在近日節(jié)律現(xiàn)象,免疫系統(tǒng)近日節(jié)律紊亂可以導致多種疾病的發(fā)生[5]。因此,免疫系統(tǒng)是否存在近日節(jié)律性變化已日益引起人們的重視。已有相關(guān)實驗表明，免疫細胞系統(tǒng)的重要成分——單核細胞(來源于骨髓單系祖細胞)存在近日節(jié)律[6]。國內(nèi)外雖然有小鼠相關(guān)免疫功能的近日節(jié)律研究報道,但其方法多為鏡下計數(shù),主觀性較強,且報道的免疫細胞種類較單一，特別是一些淋巴細胞亞型的近日節(jié)律性目前尚不清楚。

本研究以C57 BL/6小鼠為研究對象，在12 h明∶12 h暗(12 h L∶12 h D)的光暗循環(huán)條件下,對其外周血中多種免疫細胞的晝夜波動性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 動物及模型建立 雄性C57 BL/6小鼠36只(體質(zhì)量16～20 g)，4～6周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，按數(shù)字表法隨機分為6組，每組6只。然后置于恒溫(22 ℃)、恒濕及12 h L∶12 h D(8∶00-20∶00光照,20∶00-8∶00黑暗)的光暗循環(huán)條件下適應性飼養(yǎng)4周，飼養(yǎng)期間小鼠自由攝食、飲水。光照期，鼠籠中央光強度為250 lx左右，黑暗期操作時紅光強度為10～15 lx。

1.2 試劑與材料 流式Anti-Mouse CD4 APC、Anti-Mouse CD8 PE為eBioscience公司產(chǎn)品，紅細胞裂解液為BD公司產(chǎn)品。小鼠外周血液成分用法國Hemastar 3全自動血液分析儀分析。

1.3 免疫細胞的檢測方法 小鼠在上述光照循環(huán)條件下飼養(yǎng)4周后，在9∶00、15∶00、21∶00、3∶00 4個時間點眼球取血，經(jīng)Na2-EDTA抗凝處理后(1∶1),測定血液中各種免疫細胞數(shù)。測定的指標包括白細胞(WBC)、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞總數(shù)、CD4+淋巴細胞及CD8+淋巴細胞百分比。

1.4 流式分析CD4+、CD8+淋巴細胞百分比 小鼠外周血經(jīng)Na2-EDTA抗凝處理后(1∶1)，經(jīng)破紅處理,加入2 ml PBS洗滌、離心，沉淀用流式緩沖液重懸細胞。按說明書要求加入CD4+、CD8+熒光抗體，4 ℃避光孵育15 min,然后用2 ml流式緩沖液洗滌1次，上機檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理 測定結(jié)果采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用Student′st檢驗比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血WBC總數(shù)的近日節(jié)律性 見圖1。在1晝夜24 h里，WBC總數(shù)在15∶00最高,在21∶00最低，分別為(9.1±1.8)×109/L和(3.8±0.7)×109/L。峰值與谷值相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

注：與21∶00時比較aP<0.01

2.2 外周血淋巴細胞及其亞型(CD4+、CD8+)的近日節(jié)律性 如圖1所示,淋巴細胞總數(shù)15∶00達到高峰，為(8.57±1.21)×109/L；21∶00達到谷值，為(3.45±0.42)×109/L；峰值和谷值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示,CD4+淋巴細胞的百分比21∶00時最高，15∶00時最低，峰值與谷值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；CD8+淋巴細胞的百分比21∶00時最高，9∶00時最低。峰值與谷值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與15∶00時比較aP<0.01；與9∶00時比較bP<0.05

2.3 外周血中性粒細胞的近日節(jié)律性 在1晝夜24 h里，中性粒細胞數(shù)在3∶00達到峰值，為(0.127±0.009)×109/L；在9∶00達到谷值，為(0.081±0.007)×109/L。峰值和谷值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。

2.4 外周血單核細胞的近日節(jié)律性 在1晝夜24 h時間里，單核細胞數(shù)在15∶00達到峰值，為(0.487±0.031)×109/L；在21∶00達到谷值，為(0.247±0.017)×109/。峰值和谷值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。

注：與21∶00時比較aP<0.01；與9∶00時比較bP<0.05

3 討論

近日節(jié)律與機體的多種生理功能的變化關(guān)系密切,近日節(jié)律的破壞(如海上航行的倒班、值更)會導致人體產(chǎn)生多種不適、警覺性降低、情緒改變(如激越)、機體功能紊亂及疾病的發(fā)生。相關(guān)研究表明，近日節(jié)律的改變將增加患高血壓、心臟病、糖尿病及代謝性疾病、睡眠障礙和免疫功能紊亂的發(fā)生[7-8]。

船員長航、飛行員在特殊時間執(zhí)行任務均可導致免疫功能近日節(jié)律的紊亂。長期輪換班、夜間工作以及長期工作于跨時區(qū)飛行航班上的女性乘務員因近日節(jié)律經(jīng)常被打亂，乳腺癌的發(fā)病率較之對照組增高約48%[7]。流行病學資料提示[8]，夜間光照以及光照環(huán)境導致的晝夜節(jié)律紊亂會增加結(jié)腸癌的發(fā)生機會。目前已證實，免疫系統(tǒng)近日節(jié)律失調(diào)與腫瘤有關(guān)。在肝癌大鼠中發(fā)現(xiàn),不但其免疫系統(tǒng)在構(gòu)成上發(fā)生變化,免疫系統(tǒng)原有的近日節(jié)律也遭到破壞[9]。HIV感染患者T、B淋巴細胞的近日節(jié)律性逐漸喪失。另外，機體對傳染性疾病的易感性、疾病的發(fā)展進程(如風濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘)等也存在近日節(jié)律性。這些都提示免疫系統(tǒng)近日節(jié)律的改變是這些疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。有效防治這些與免疫功能近日節(jié)律紊亂相關(guān)的疾病的前提是要明晰正常狀態(tài)下各免疫細胞的近日節(jié)律性。

筆者系統(tǒng)研究了在12 h L∶12 h D光暗循環(huán)條件下小鼠外周血中各免疫細胞的近日節(jié)律性。先前也有相關(guān)文獻報道了小鼠外周血內(nèi)免疫細胞的晝夜變化規(guī)律，但只選擇了幾個指標進行研究[10-11]，國內(nèi)關(guān)于免疫細胞及功能的近日節(jié)律性研究較少，相關(guān)研究也不夠系統(tǒng)。本研究表明C57 BL/6小鼠外周血白細胞的趨勢與國外相關(guān)報道一致[12]。本研究進一步檢測了C57 BL/6小鼠外周血中的其他免疫成分,結(jié)果表明正常小鼠的外周血WBC計數(shù)、淋巴細胞百分比、單核細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)均存在著晝夜節(jié)律性。各類淋巴細胞的峰值均在15∶00-21∶00之間，單核細胞的百分比在15∶00達到高峰，中性粒細胞在3∶00達到高峰，說明小鼠外周血中各免疫細胞的峰值和谷值不在同一時間段,存在此消彼長的現(xiàn)象。這種方式可能有利于小鼠在不同時間段維持一定的免疫力。

綜上所述，本研究較系統(tǒng)地研究了C57BL/6小鼠外周血中各免疫細胞的近日節(jié)律性變化，不僅為深入理解免疫系統(tǒng)的機制提供依據(jù)，也為實驗動物學及免疫功能近日節(jié)律紊亂相關(guān)疾病的臨床治療打下基礎，為深入理解軍事人員(如長航艦員及跨時區(qū)飛行的飛行員)由于工作崗位的需要導致的免疫系統(tǒng)近日節(jié)紊亂提供理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Habbal OA, Al-Jabri AA. Circadian rhythm and the immune response: a review[J]. Int Rev Immunol， 2009,28(1): 93-108.

[2] Schibler U, Ripperger J, Brown SA．Peripheral circadian oscillators in mammals:time and food[J].J Biol Rhythms,2003,18(3):250-260．

[3] Maren K, Jeannine M, Ute A, et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses[J]. PNAS,2009,106(50): 21407-21412.

[4] 王慶敏,唐瑛,時粉周,等.哺乳動物近日節(jié)律的研究進展[J]. 海軍醫(yī)學雜志,2012，33(1):61-63.

[5] Fabio L, Caroline K, Anita L. Consequences of sleep deprivation on neurotransmitter receptor expression and function[J].Europ J Neutos, 2009,29(9):1810-1819.

[6] Halder B， Haubler D, Gupta D. Effect of pineal gland on circadian rhythmicity of colony forming units granulocytes and macrophages(CFU-GM) from rat bone marrow cell cultures[J].J Pineal Res,1992,12(2):79-83.

[7] Trufakin VA, Shurlygina AV, Michurina SV, et al. The influence of experimental desynchronosis on the morphofunctional characteristics of mouse immune system[J]. Alaska Med, 2007, 49(2 Suppl):169-176.

[8] Castanon-Cervantes O, Wu M, Ehlen JC,et al. Dysregulation of inflammatory responses by chronic circadian disruption[J]. J Immunol,2010,185(10):5796-805.

[9] 王秀.肝癌大鼠免疫系統(tǒng)的晝夜節(jié)律實驗研究[J].皖南醫(yī)學院學報,2006,25(2)：127-129.

[10] 鄭升,周偉良,彭惠芬.小鼠外周血白細胞數(shù)與腫瘤化療活性的實驗觀察[J].實用腫瘤雜志,1989,4(3):173-175.

[11] 楊迎暴,李經(jīng)才,徐峰，等.正常小鼠免疫功能的晝夜節(jié)律性[J].沈陽藥學大學學報,1996,13(2):134-136.

[12] Kolaczkowska E, Chadzinska M, Seljelid R, et al.Strain and laboratory routines:studies of male C57BL/6J,Balb/c and CB6 F1 mice[J].Laborat Anim, 2001,35(1):91-100.