郭海周，趙 松，崔廣暉，李瑋浩，王建軍，江 科

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科 鄭州 450052 2)華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科 武漢 430022

排斥反應以及免疫抑制相關并發(fā)癥對肺移植患者術后存活時間和生存質量構成嚴重挑戰(zhàn)，采取一定措施使受體對供體抗原產生長期耐受而又不影響其他免疫功能有望解決以上難題。調節(jié)性T細胞(Treg)由于具備發(fā)揮自我耐受和保持免疫穩(wěn)態(tài)的特性，正在成為移植領域一項頗具前景的治療策略。在大鼠心臟移植模型中，CD8+Treg可以通過直接接觸方式或者由吲哚胺2，3-雙加氧酶發(fā)揮免疫調節(jié)作用，從而產生移植耐受[1]，但其對肺移植的作用尚未有相關的研究。作者觀察了大鼠原位肺移植后CD8+Treg的變化，報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物選用SPF級8～10周Lewis大鼠35只和6～8周Wistar大鼠20只(均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)構建原位左肺移植模型[2]，其中同種移植組(n=20)為Wistar→Lewis，同基因移植組(n=5)為Lewis→Lewis。對照組(n=5)選取Lewis大鼠，左側開胸后單純肺門阻斷30 min構建假移植模型[3]。對照組與同基因移植組動物于術后7 d被處死取材；同種移植組動物分批于術后3、7、14、28 d被處死取材；每批5只。

1.2標本采集全麻及氣管插管后正中切開胸腹部，肝素化后切除脾臟，研磨法獲取單細胞懸液，加入紅細胞裂解液去除紅細胞，留取白細胞備用。右心房抽取2 mL靜脈血，PBS倍比稀釋后小心加到淋巴細胞分離液表層，提取外周血單個核細胞(PBMC)備用。切除左心耳，PBS右室流出道灌注，沖凈肺內血液。整塊切除心肺組織，1.5 mL PBS經氣管左肺灌洗(4次)。切除左肺門部淋巴結1～2枚，研磨法獲取淋巴細胞備用。切除左肺，均分3份分別用于常規(guī)病理檢查、流式細胞術及凍存?zhèn)浞荨?/p>

1.3實驗試劑小鼠抗大鼠CD3-FITC、CD8-PE-Cy7、CD25-APC及破膜穿孔液購自eBioscience公司；小鼠抗大鼠CD4-APC、CD4-APC-Cy7及CD45RC-PE購自Biolegend公司；兔抗CD3、CD4、CD8多克隆抗體購自Bioss Inc公司；膠原酶Ⅰ和RPMI 1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；DNA酶及戊巴比妥鈉購自Sigma-Aldrich公司。其他常用分子生物學試劑購自湖北醫(yī)藥集團，均為分析純。

1.4肺組織HE染色40 g/L多聚甲醛固定切除的肺組織24 h，乙醇梯度脫水透明，蠟塊包埋保存，制5 μm厚組織切片，脫蠟后染色，之后脫水透明，封片觀察。

1.5流式細胞術將擬勻漿肺組織剪碎后加入膠原酶Ⅰ溶液3 h，制作單細胞懸液。取5×(105～106)個細胞，參照流式細胞術抗體說明書加入適量的表面抗體，冰上避光反應30 min。PBS洗滌后加入500 μL Foxp3固定/穿孔工作液，冰上破膜30 min。穿孔緩沖液洗滌后加入抗Foxp3-PE，30 min后PBS洗滌2次，上流式細胞儀檢測各亞型淋巴細胞。實驗重復5次。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0進行分析，移植術后1周同基因移植組和同種移植組間CD8+Treg所占比例的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1同種移植組與同基因移植組大鼠肺組織的病理變化同種移植組肺組織切片可見到與人類肺移植后排斥反應相當?shù)牡湫捅憩F(xiàn)，即環(huán)血管浸潤的袖狀單個核細胞群。術后3 d排斥反應以1～2級為主，術后7 d以2～3級為主，術后2周后則以3級以上病變?yōu)橹?。而同基因移植組和對照組肺組織切片鏡下觀察接近正常。見圖1。

圖1 各組大鼠肺移植1周后肺組織HE染色結果(×100)

2.2CD8+CD45RC-Treg對移植肺的免疫調節(jié)作用將淋巴細胞以CD45RC進行標記后，可以看到，CD8+T細胞分為CD8+CD45RC+和CD8+CD45RC-2群，同基因移植組肺組織中CD8+CD45RC-占CD8+T細胞的比例高于同種移植組[(30.68±5.25)%vs(18.04±4.65)%，t=4.030，P=0.004]。

2.3肺移植后CD8+CD45RC-Treg的空間分布規(guī)律不同組織CD8+CD45RC-Treg占CD3+和CD8+T細胞的比例見表1、2。

表1 肺移植1周后不同組織CD8+CD45RC-Treg/CD3+的差異 %

表2 肺移植后1周后不同組織CD8+CD45RC-Treg/CD8+的差異 %

2.4肺移植后CD8+CD45RC-Treg的時間分布規(guī)律對同種移植組的肺組織觀察結果顯示，隨著術后時間的延長和排斥強度的增加，其數(shù)量呈下降趨勢。

3 討論

近年來，人們發(fā)現(xiàn)，體內存在一些具有調節(jié)屬性的CD8+T細胞。經過抗CD3處理后或者在上皮細胞、抗原的慢性刺激下，機體出現(xiàn)能夠抑制淋巴細胞增殖的CD8+T細胞[4-8]，在功能上它們均屬于Treg范疇，但細胞表型卻呈現(xiàn)出較大的異質性，目前尚未發(fā)現(xiàn)CD8+Treg的特征性標志物。

作者以CD45RC對大鼠的CD8+T細胞進行標記，將CD8+T細胞分為CD45RC+和CD45RC-2個類型。研究[4]證實，在體外抗原提呈細胞作用下，CD45RC+CD8+T細胞能分泌IL-2和IFN-γ,具備細胞毒性功能，而CD45RC-CD8+T細胞則能通過分泌IL-4、IL-10和IL-13，發(fā)揮調節(jié)功能。對于接受過供體特異性血液輸注的大鼠，移植肝臟內持續(xù)性的CD45RC-浸潤有助于延長移植物存活時間[9]，說明在功能上CD45RC-CD8+T細胞應該歸類于CD8+Treg。在該研究中，作者順利地檢測到了該群細胞，提示其在肺移植術后的免疫耐受方面可能通過特定機制發(fā)揮作用。和CD8+CD25+Foxp3+Treg不同的是，其在淋巴細胞內占有較高的比例，經過2個表面標志物即能達到鑒定和高通量分離的目的。

研究表明，在靈長類和嚙齒類生物中，當以CD40免疫球蛋白阻斷CD40-CD40L間的相互作用后能夠誘導CD8+CD45RC-Treg的產生[10]，從而導致MHC完全不匹配的同種異體移植物的免疫耐受[1, 11]。在該研究中，可以看到，同基因移植的肺組織內該群細胞的數(shù)量要多于同種移植者。提示該群細胞可能作為一種保護因素存在于肺組織中，其所具有的免疫調節(jié)作用有助于減輕移植術后的肺排斥。

進一步比較不同組織間CD8+CD45RC-Treg的差異，同基因移植組肺組織和肺門淋巴結內該群細胞比例高于同種移植組，而在血液和脾臟中差別不大，提示該群細胞可能主要在局部發(fā)揮免疫調節(jié)作用。導致這種區(qū)域性差異分布的原因目前尚不清楚，可能與循環(huán)Treg向移植肺內移動有關，也可能是局部Treg的擴增或者非Treg向Treg轉化的結果[12]。

[1] Li XL, Menoret S, Bezie S, et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance[J]. J Immunol, 2010, 185(2):823

[2] Guo H, Nie J, Fan K, et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant[J]. Eur J Med Res, 2013, 18(1):1

[3] 郭海周, 張春芳, 張恒. 鼠肺缺血預處理后肺組織中熱休克蛋白27檢測[J]. 鄭州大學學報:醫(yī)學版, 2009, 44(1):81

[4] Xystrakis E, Cavailles P, Dejean AS, et al. Functional and genetic analysis of two CD8 T cell subsets defined by the level of CD45RC expression in the rat[J]. J Immunol, 2004, 173(5):3140

[5] Subra JF, Cautain B, Xystrakis E, et al. The balance between CD45RChigh and CD45RClow CD4 T cells in rats is intrinsic to bone marrow-derived cells and is genetically controlled[J]. J Immunol, 2001, 166(5):2944

[6] Bisikirska B, Colgan J, Luban J, et al. TCR stimulation with modified anti-CD3 mAb expands CD8+ T cell population and induces CD8+CD25+ Tregs[J]. J Clin Invest, 2005, 115(10):2904

[7] Allez M, Brimnes J, Dotan I, et al. Expansion of CD8+ T cells with regulatory function after interaction with intestinal epithelial cells[J]. Gastroenterology, 2002, 123(5):1516

[8] Lu L, Cantor H. Generation and regulation of CD8(+) regulatory T cells[J]. Cell Mol Immunol, 2008, 5(6): 401

[9] Miyanari N, Yamaguchi Y, Matsuno K, et al. Persistent infiltration of CD45RC-CD4+ T cells, Th2-like effector cells, in prolonging hepatic allografts in rats pretreated with a donor-specific blood transfusion[J]. Hepatology, 1997, 25(4):1008

[10]Guillonneau C, Hill M, Hubert FX, et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase[J]. J Clin Invest, 2007, 117(4):1096

[11]Guillot C, Guillonneau C, Mathieu P, et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection[J]. J Immunol, 2002, 168(4): 1600

[12]Neujahr DC, Cardona AC, Ulukpo O, et al. Dynamics of human regulatory T cells in lung lavages of lung transplant recipients[J]. Transplantation, 2009, 88(4):521