許曉峰 張學(xué)進 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤血液科 杭州 310003

程汝濱 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院

高瑞蘭 浙江省中醫(yī)院血液病研究所

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，蔬菜中存在的一些化合物具有抗癌活性，尤其是富含胡蘿卜素的蔬菜，胡蘿卜、西蘭花、椰菜及菠菜等[1-3]，這些蔬菜富含多種芥子苷，經(jīng)黑芥子硫酸苷酶酶解（myrosinase）或酸水解后產(chǎn)生蘿卜硫素。蘿卜硫素（sulforaphane，簡稱SF）是活力最強的一類異硫氰酸鹽，它的抗癌作用已在大鼠的乳腺癌中得到充分證明[4]，其對實體腫瘤的研究比較深入，但對白血病的研究很少。曾有學(xué)者報道SF 對HL-60細胞有抑制作用[5]，但有關(guān)蘿卜硫素與白血病細胞藥物敏感性研究尚未見報道。因此，本研究采用白血病細胞體外集落形成藥敏試驗法和MTT 法探討SF 與白血病化療藥物敏感性的關(guān)系，報道如下。

1 實驗材料

1.1 靶細胞 HL-60 白血病細胞株：購自中科院上海細胞所。人原代白血病細胞：來自2010 年7 月-2012年11 月浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院血液科住院患者，共17 例，男12 例，女5 例，年齡15～76 歲；初治3 例，復(fù)發(fā)14 例。均經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)染色確診為髓系白血病，診斷均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[6]，按FAB 協(xié)作組分型確定M15 例，M210 例，M32 例。

1.2 主要試劑和藥品 蘿卜硫素（購自杭州臨安天鴻生物科技有限公司，純度98%，批號TH110720）；高三尖杉酯堿（Hom，杭州民生藥業(yè)集團有限公司）；阿糖胞苷（Ara-c，杭州民生藥業(yè)集團有限公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；IMDM 培養(yǎng)基（Gibco）；青霉素鈉（山東魯抗制藥）；硫酸鏈霉素（華北制藥公司）；96 孔培養(yǎng)板（美國Becton）；四唑藍（上海生工）；二甲基亞砜（國產(chǎn)分析純）；無菌水（平沙普愛思制藥公司）。

1.3 儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus）；移液器（P-20，P-200，法國Gilson）；普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）；倒置顯微鏡（日本Olympus）；層流潔凈室（蘇州凈化）；低溫冰箱（日本三洋）；恒溫水浴箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；電子天平（瑞士Mettler-toledo）；水平式離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；酶標(biāo)儀（BIO-TEX INSTRUMENTS.INC）；游標(biāo)卡尺（上海精密儀器儀表公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞株培養(yǎng) HL-60 白血病細胞株常規(guī)接種于含10%滅活小牛血清、青霉素和鏈霉素各100U/mL的IMDM 培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中懸浮培養(yǎng)，每2～3 天換液。實驗時取對數(shù)生長期的細胞。

2.2 化療藥物 選擇臨床常用的Hom 和Ara-c，瓊脂半固體集落培養(yǎng)和MTT 法均經(jīng)預(yù)實驗體外培養(yǎng)對白血病細胞克隆抑制的生長曲線，確定恰當(dāng)濃度用于實驗。

2.3 瓊脂半固體集落培養(yǎng)法 取對數(shù)生長期的HL-60 細胞進行集落培養(yǎng)實驗。

2.3.1 抑制實驗 經(jīng)1 000rpm/min 離心5min，收集細胞。2mL 培養(yǎng)體系含20%小牛血清，青霉素、鏈霉素各100U/mL，0.3%瓊脂的IMDM 培養(yǎng)液，實驗組SF 的終濃度分別為5、10、20、40μmol/L，以不加SF為對照組。每濃度設(shè)3 個平行孔，接種細胞數(shù)均為2.0×102/0.5mL/孔。

2.3.2 協(xié)同實驗 2mL 培養(yǎng)體系除含上述各組分外，再加入Hom，終濃度為5μg/L，抑制率為（20.2±6.7）%；加入Ara-c，終濃度為2μg/L，抑制率分別為（19.7±5.5）%，以不加SF 和化療藥物為對照組。

將上述不同組合的細胞均置于37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中，6 天后計數(shù)集落，根據(jù)各細胞株增殖潛能的不同，計數(shù)集落標(biāo)準(zhǔn)定為CFU-K562 和CFU-HL-60 集落（＞40 個細胞），并計算各實驗組對細胞生長的抑制率，抑制率=（1-A實驗組/A對照組）×100%。

2.4 PHA-LCM 液相－半固體二步培養(yǎng)法[7]

2.4.1 抑制實驗 觀察不同濃度SF 對人原代白血病細胞的作用。將未經(jīng)治療的急性髓系白血病(AML)患者的骨髓標(biāo)本沿試管壁加于淋巴細胞分離液上，1 500rpm/min 離心15min，吸取單個核細胞，單IMDM培養(yǎng)液洗滌1 次，離心棄上清，加入雙IMDM 培養(yǎng)液使成2×106/mL 的細胞懸液。實驗組SF 的濃度分別為5、10、20、40μmol/L，以不加SF 為對照組。總體積2mL，設(shè)3 個平行孔，接種細胞數(shù)為105/0.5mL/孔。

2.4.2 協(xié)同實驗 觀察SF 與化療藥物Hom 和Ara-c 的聯(lián)合作用。2mL 培養(yǎng)體系中各組分和不同濃度的SF 均與上述增殖實驗相同，再分別加入終濃度為0.5mg/L Hom 和25mg/L Ara-c，抑制率分別為（22.6±16.0）%和（21.5±9.9）%，以不加SF 和化療藥物為對照組，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中孵育1h，用單IMDM 培養(yǎng)液洗滌1 次，離心棄上清，加入雙IMDM 培養(yǎng)液使成2×106/mL 的細胞懸液。

將上述不同組合的細胞均用20%的植物血凝素-白細胞條件培養(yǎng)基（PHA-LCM）作刺激因子孵育20h，然后加入瓊脂進行半固體集落培養(yǎng)，培養(yǎng)體系含20%的馬血清、10%的PHA-LCM 和0.3%的瓊脂，均置于37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)7天后，計數(shù)白血病集落數(shù)（＞40 個細胞），并計算各實驗組對細胞生長的抑制率，抑制率=（1-A實驗組/A對照組）×100%。按化療藥物抑制率＞30%作為對該藥敏感，而＜30%為對該藥不敏感的標(biāo)準(zhǔn)來判斷[8]。

2.5 MTT 法檢測SF 對HL-60 細胞增殖的影響及其與化療藥物的聯(lián)合作用

2.5.1 抑制實驗 實驗分為對照組和實驗組，SF 終濃度分別為0.5、10、20、40μmol/L，藥物干預(yù)時間為48h，每組設(shè)3 個復(fù)孔。收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液密度至5×104個/mL，96 孔板每孔接種100μL后，加入含不同濃度SF 的新鮮培養(yǎng)液80μL 培養(yǎng)48 h，每孔加入20μL MTT 溶液（5g/L，終濃度0.5g/L），細胞培養(yǎng)箱放置4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液后，每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀490nm 處測定各孔的吸光度值（A490nm）。實驗獨立重復(fù)3 次。取三個孔的平均值，并計算各實驗組對細胞生長的抑制率，抑制率=（1-A實驗組/A對照組）×100%。

2.5.2 協(xié)同實驗 試驗分四組：空白對照組（不加SF）、SF 組（5μmol/L）、化療藥組和SF 聯(lián)合化療藥組，培養(yǎng)體系除與上述抑制實驗相同外，化療藥組中加入化療藥80μL/孔，SF 聯(lián)合化療藥組中SF 和化療藥各加入40μL/孔，Hom 終濃度為0.025mg/L，抑制率為（20.3±7.1）%；Ara-c 終濃度為0.05mg/L，抑制率為（21.1±5.4）%。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0 軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SF 對HL-60 細胞株集落生長的抑制作用 SF對HL-60 細胞的集落生長的抑制作用呈濃度依賴性，10μmol/L SF 即顯示輕度的抑制作用，集落數(shù)為（127.5±7.8）個，抑制率為（8.1±3.1）%，和對照組比較，P＜0.05。當(dāng)濃度增加至40μmol/L，其抑制作用更加明顯，集落數(shù)為（36.5±4.2）個，抑制率為（74.1±9.0）%，明顯少于對照組（P＜0.01），見表1。

表1 SF 對HL-60 細胞集落的作用（）

表1 SF 對HL-60 細胞集落的作用（）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.2 SF 聯(lián)合化療藥物對HL-60 的抑制作用 當(dāng)SF與化療藥Hom 合用時，Hom 濃度不變（5μg/L），對HL-60 細胞的抑制與SF 呈劑量依賴關(guān)系，5μmol/L就可與Hom 起協(xié)同作用，集落數(shù)為（95.9±12.5）個，與單用相同濃度SF 的集落數(shù)（132.1±8.1）個比較，P＜0.05，抑制率從（4.5±1.9）%升至（31.0±2.1）%，顯著抑制HL-60 細胞集落的生成。隨著SF 濃度的增加，抑制作用逐漸增強，當(dāng)濃度增加至20μmol/L 時，集落數(shù)為（52.3±7.0）個，抑制率為（62.3±5.7）%。當(dāng)不同濃度的SF 與化療藥Ara-c 合用時，對HL-60 細胞的抑制與SF 也呈劑量依賴關(guān)系。

以上結(jié)果提示SF 能夠增強K562 和HL-60 細胞對化療藥物的敏感性，見表2～3。

3.3 PHA-LCM 液相－半固體二步培養(yǎng)SF 抑制人原代白血病細胞生長 SF 對人原代白血病細胞集落（CFU-AML）生長的抑制作用呈濃度依賴性，10μmol/L SF 就顯示輕度的抑制作用，集落數(shù)為（88.5±29.3）個，抑制率為（35.6±14.5）%，與對照組的集落數(shù)（131.1±34.0）個相比較，P＜0.05；當(dāng)濃度增加至40μmol/L，其抑制作用更加明顯，集落數(shù)為（46.9±26.7）個，抑制率為（68.6±22.3）%，明顯少于對照組（P＜0.01），見表4。

表2 SF 協(xié)同Hom 抑制HL-60 集落生成作用（）

表2 SF 協(xié)同Hom 抑制HL-60 集落生成作用（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與對應(yīng)SF 濃度組比較，ΔP＜0.05

表3 SF 協(xié)同Ara-c 抑制HL-60 細胞集落生成作用（）

表3 SF 協(xié)同Ara-c 抑制HL-60 細胞集落生成作用（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與對應(yīng)SF 濃度組比較，ΔP＜0.05

表4 SF 對人原代白血病細胞集落的影響（）

表4 SF 對人原代白血病細胞集落的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.4 PHA-LCM 液相－半固體二步培養(yǎng)SF 協(xié)同化療藥抑制人原代白血病細胞生長 當(dāng)SF 濃度為5μmol/L 時，和化療藥Hom 聯(lián)合使用后，人原代白血病細胞集落（CFU-AML）集落數(shù)為（65.7±26.6）個，抑制率為（50.8±14.4）%，明顯大于單用相同濃度SF 的（127.5±27.1）個和（7.2±3.6）%，P＜0.05。隨著SF 濃度增加，兩藥協(xié)同作用對CFU-AML 的影響越大，當(dāng)SF濃度為40μmol/L 時，集落數(shù)為（2.8±2.6）個，抑制率為（97.4±2.8）%，見表5。

當(dāng)SF 濃度為5μmol/L 時，和化療藥Ara-c 聯(lián)合使用后，CFU-AML 集落數(shù)為（87.3±26.8）個，抑制率為（40.0±8.7）%，明顯大于單用相同濃度SF 的（127.5±27.1）個和（7.2±3.6）%，P＜0.05。隨著SF 濃度增加，兩藥協(xié)同作用對CFU-AML 的影響越大，當(dāng)SF濃度為40μmol/L 時，集落數(shù)為（3.9±3.2）個，抑制率為（96.4±4.2）%，見表6。

表5 SF 協(xié)同Hom 對人原代白血病細胞集落的影響（） 個

表5 SF 協(xié)同Hom 對人原代白血病細胞集落的影響（） 個

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對應(yīng)SF 濃度組比較，ΔP＜0.05

表6 SF 協(xié)同Ara-c 對人原代白血病細胞集落的影響（） 個

表6 SF 協(xié)同Ara-c 對人原代白血病細胞集落的影響（） 個

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對應(yīng)SF 濃度組比較，ΔP＜0.05

3.5 MTT 法培養(yǎng)SF 抑制HL-60 細胞增殖 MTT法檢測到5μmol/L SF 時吸光度值為1.01±0.06，與對照組比較，P＜0.05；40μmol/L SF 顯示明顯的HL-60細胞生長抑制，吸光度為0.26±0.03，與對照組比較，P＜0.01，見表7。

表7 不同濃度SF 對HL-60 細胞的作用（）

表7 不同濃度SF 對HL-60 細胞的作用（）

注：與對照組比較，**P＜0.05，**P＜0.01

3.6 MTT 法檢測SF 與化療藥的協(xié)同作用 以5μmol/L SF 和0.025mg/L 化療藥物Hom 合用，SF 能增強Hom 對HL-60 細胞的的殺傷作用，吸光度為0.59±0.09，明顯小于空白對照組，抑制率為（59.3±7.6）%，P＜0.01，見表8。

表8 SF 與Hom 對HL-60 細胞的協(xié)同殺傷作用（）

表8 SF 與Hom 對HL-60 細胞的協(xié)同殺傷作用（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01

以5μmol/L SF 和0.05mg/L 化療藥物Ara-c 合用，SF 能增強Ara-c 對HL-60 細胞的的殺傷作用，吸光度為0.51±0.08，明顯小于空白對照組，抑制率為（62.2±8.5）%，P＜0.01，見表9。

表9 SF 與Ara-c 對HL-60 細胞的協(xié)同殺傷作用（）

表9 SF 與Ara-c 對HL-60 細胞的協(xié)同殺傷作用（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01

4 討論

蘿卜硫素又稱萊菔子素，就其化學(xué)成分而言,為異硫代氰酸鹽衍生物，易溶于水，它是迄今為止蔬菜中發(fā)現(xiàn)的最強的抗癌成分。大量實驗證明，蘿卜硫素對食道癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌及大腸癌等有很好的防治效果[9-10]。其后也有學(xué)者報道[11]，L-蘿卜硫素對K562 和HL-60 細胞有誘導(dǎo)凋亡作用，但對于蘿卜硫素增加白血病細胞對化療藥敏感性尚未有更多研究。

在過去的20 年中，白血病的完全緩解率和總生存率（OS）明顯改善，但化療藥的毒副反應(yīng)和耐藥仍是治療失敗導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。尋找一種既能提高化療效果又安全可行的植物有效成分是現(xiàn)在抗白血病研究的熱點。在本研究中，化療藥濃度保持不變，瓊脂半固體培養(yǎng)和MTT 法均證實了蘿卜硫素聯(lián)合Hom 和Ara-c 比單用Hom 和Ara-c 對HL-60 白血病細胞抑制率明顯增加（P＜0.05），而且該實驗使用人原代白血病細胞，也證實了此結(jié)果。

有文獻報道[12]，造血生長因子（G-CSF 和GMCSF）與化療藥物具有協(xié)同作用。因為白血病細胞能表達G-CSF 和GM-CSF 受體，造血生長因子與之結(jié)合后可促進細胞生長，從而誘導(dǎo)更多的白血病細胞進入周期細胞，使化療藥物的作用大大增強。臨床上也證實同時使用造血生長因子（G-CSF 和GM-CSF）與化療藥，對白血病細胞的殺傷力確實比較大，治療效果也比較好，比如CAG 方案。因此蘿卜硫素聯(lián)合化療藥能使患者的白血病細胞對化療藥敏感性增加，可能是通過促進細胞進入增殖周期所致。

本組結(jié)果提示，蘿卜硫素能抑制白血病細胞增殖，并能增加化療藥Hom 和Ara-c 對白血病細胞的殺傷作用，具有協(xié)同作用，但是具體機制尚未研究。總之，蘿卜硫素具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，值得進一步開展臨床研究。

［1］Joseph MA，Moysich KB，F(xiàn)reudenheim JL，et al.Cruciferolls vegetables，genetic polymorphisms in glutathione Stransferases M1 and T1，and prostate cancer risk［J］.Nutrition and Cancer，2004，50（2）：206-213.

［2］Graham PB，Yongping B，Gary W.Sulforaphane and its glutathione conjugate but not sulforaphane nitrile in－duceUDP-glucuronsyl transferase（UGT1A1）and glutathione transferase（GSTA1）in cultured cell［J］.Carcinogenesis，2002，23（8）：1399-1404.

［3］Srinibas D，Amrish KT，Harjit K.Cancer modulation by glucosinolates：a review［J］.Current Science，2000，79（12）：1665-1671.

［4］李志邈，曹家樹.蔬菜的抗癌特性［J］.北方園藝，2001，4：4-6.

［5］沈蓮清，蘇光耀，王奎武.西蘭花種子中硫苷酶解產(chǎn)物蘿卜硫素的提純與抗腫瘤的體外試驗研究［J］.中國食品學(xué)報，2008，8（5）：15－21.

［6］張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)［S］.第2 版.北京：科學(xué)出版社，1998：168-193.

［7］高瑞蘭，金錦梅，馬逢順.急性髓細胞白血病集落生長的研究［J］.浙江醫(yī)學(xué)，1991，13（2）：4-6.

［8］馬逢順，高瑞蘭，金錦梅，等.白血病祖細胞集落形成及對高三尖杉酯堿和阿糖胞苷兩藥的敏感性測定［J］.中華內(nèi)科雜志，1989，28（12）：737-740.

［9］Pham NA，Jacobberger JW，Schimmer AD，et al.The dietary isothiocyanate sulforaphane targets pathways of apoptosis，cell cycle arrest，and oxidative stress in human pancreatic cancer cells and inhibits tumor growth in severe combined immunodeficient mice［J］.Molecular Cancer Therapeutics，2004，3（10）：1239-1248.

［10］Misiewicz I，Skupinska K，Kasprzycka-Guttman T.Sulforaphane and 2-oxohexyl isothiocyanate induce cell growth arrest and apoptosis in L-1210 leukemia and ME-18 melanomacells［J］.OncologyReports，2003，10（6）：2045-2050.

［11］Rajendra Sharma，Abha Sharma，Pankaj Chaudhary，et al.Role of Lipid Peroxidation in Cellular Responses to D，LSulforaphane，A Promising Cancer Chemopreventive Agent［J］.Biochemistry，2010，49（14）：3191-3202.

［12］Li J M，Shen Y，Wu DP，et al.A clarubicin and low-dose Cyto sine arabinoside in combination with granulocyte colony-stimulating factor in treating acute myeloid leukemia patients with relapsed or refractory disease and myelody splastic syndrome：a multicenter study of 112 chinese patients［J］.Int J Hematol，2005，82：48-54.