黃火高，韓春光，劉永學(xué)，郭啟煜

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種累及外周小關(guān)節(jié)為主的進(jìn)行性破壞性的慢性自身免疫性炎性疾病。盡管近年對RA機制的進(jìn)一步認(rèn)識推動對該病治療的進(jìn)展，但是目前臨床上仍存在諸多難題，RA的詳盡發(fā)病機制仍有待深入研究[1]。過氧化物酶體增殖物活化型受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)是一類配體依賴的核受體。研究表明，激活PPAR γ可調(diào)控多種基因表達(dá)，并產(chǎn)生抗炎作用[2]。PPAR γ激動劑吡格列酮可顯著抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collageninduced arthritis，CIA)[3]。S100A8/A9 為一組鈣衛(wèi)蛋白，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中重要炎性介質(zhì)[4]。本實驗通過大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型，檢測PPARγ激動劑吡格列酮對滑膜表達(dá)S100A8/A9 mRNA的影響，以探討 PPARγ在RA中作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar雄性大鼠(200±20)g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供并飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 吡格列酮由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司惠贈。牛Ⅱ型膠原及不完全弗氏佐劑為美國Sigma產(chǎn)品?？俁NA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒和DL2000 DNA Marker為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。引物由北京賽百勝生物有限公司合成并純化。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和用藥方法 將20只大鼠編號。隨機抽取3只大鼠飼養(yǎng)至首批關(guān)節(jié)炎大鼠到達(dá)實驗終點時作為正常對照組。余下17只大鼠經(jīng)二次強化免疫后每日依次查看，以發(fā)生關(guān)節(jié)炎時間先后順序再隨機入組，分為模型對照組、吡格列酮用藥大劑量組[20 mg/(kg·d)]和吡格列酶用藥小劑量組[4 mg/(kg·d)]，進(jìn)入實驗的大鼠每組各3只，多余大鼠廢用。將吡格列酮均勻混懸于1%羧甲基纖維素鈉懸液中。吡格列酮用藥組大鼠入組當(dāng)天開始灌胃給藥，1/d，連續(xù)14 d。模型對照組大鼠以同樣方式給予等體積的1%羧甲基纖維素鈉混懸液。

1.2.2 CIA模型誘導(dǎo) 依據(jù)本實驗組建立的方法[5]制作制備膠原乳液并誘導(dǎo)CIA模型。簡述如下:大鼠麻醉后，將背部及尾根部去毛，按照每只250 μl皮內(nèi)多點注射Ⅱ型膠原乳液(4 mg/ml)進(jìn)行初次免疫，間隔7 d后二次注射強化免疫。

1.2.3 RT-PCR檢測滑膜目的基因mRNA表達(dá)二次強化免疫大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)作滿14 d后將大鼠麻醉，打開脛跗關(guān)節(jié)，沿著骨骼周邊用眼科剪與手術(shù)刀片剪切滑膜及其周圍組織，于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中快速洗滌1遍后立即轉(zhuǎn)入裝有1 ml Trizol試劑的組織勻漿器中研磨，以抽提總RNA。檢測獲得的RNA量和純度后以20 μl體系將3 μg的 RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA模板，用于PCR檢測。所用引物序列和PCR條件見表1。除了退火溫度和循環(huán)數(shù)，反應(yīng)程式其他部分均相同:94℃預(yù)變性2 min進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45 s，不同溫度下退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5 min，降至4℃。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳并成像分析，以美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)開發(fā)的軟件ImageJ對產(chǎn)物條帶吸光度值進(jìn)行計算。結(jié)果以“目的基因/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)”比值表示。

表1 所用引物序列資料及PCR條件

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組比較用t檢驗，兩組以上比較用單因素方差分析，后續(xù)兩兩比較用最小顯著性差異法(least-significant difference，LSD)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIA 滑膜 PPARγ mRNA表達(dá)變化 PPARγ mRNA在正常對照組大鼠滑膜僅極少量表達(dá)(0.03±0.01)，而在模型對照組大鼠滑膜表達(dá)明顯增高(0.14±0.01)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 正?；100A8 mRNA和S100A9 mRNA固有表達(dá) 正常對照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜僅微量表達(dá)S100A8 mRNA(0.01±0.01)和S100A9 mRNA(0.20±0.07)。

2.3 關(guān)節(jié)炎滑膜S100A8 mRNA和S100A9 mRNA的表達(dá)及吡格列酮的影響 CIA后14 d模型對照組大鼠滑膜組織表達(dá)S100A8 mRNA和S100A9 mRNA顯著增高;吡格列酮小劑量用藥組滑膜表達(dá)S100A8 mRNA和S100A9 mRNA明顯低于模型對照組，抑制率分別為62.7%和34.2%;吡格列酮大劑量用藥組滑膜表達(dá)S100A8 mRNA和S100A9 mRNA顯著低于模型對照組，抑制率分別為82.1%和71.9%(P＜0.01，圖1及表2)。吡格列酮大、小劑量組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 吡格列酮對滑膜組織S100A8 mRNA和S100A9 mRNA表達(dá)的影響

表2 各組大鼠滑膜組織S100A8 mRNA和S100A9 mRNA表達(dá)結(jié)果(±s)

表2 各組大鼠滑膜組織S100A8 mRNA和S100A9 mRNA表達(dá)結(jié)果(±s)

注:與模型對照組比較，*P＜0.01

組 別S100A8 mRNA S100A9 mRNA模型對照組1.23 ±0.06 1.07 ±0.11吡格列酮小劑量組 0.46 ±0.08* 0.71 ±0.06*吡格列酮大劑量組 0.22 ±0.02* 0.30 ±0.03*

3 討論

S100A8 mRNA和S100A9 mRNA屬于S100家族，主要表達(dá)于粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，與髓系細(xì)胞分化密切相關(guān)[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)S100A8 mRNA和S100A9 mRNA與滑膜炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[4]，其中S100A8 mRNA可加重病情并介導(dǎo)RA的骨破壞[6]。

核受體PPAR γ的主要功能是在mRNA水平調(diào)控基因的表達(dá);吡格列酮是PPARγ高親和力的配體[2]。本實驗選擇吡格列酮，旨在通過觀察該配體激活PPARγ后目的基因表達(dá)的變化，以研究PPARγ激活的效應(yīng)。PPARγ mRNA在CIA發(fā)生14 d后表達(dá)明顯增高，為藥物發(fā)生作用提供了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，吡格列酮明顯抑制S100A8 mRNA和S100A9 mRNA的表達(dá)，并存在劑量依賴關(guān)系，提示激活PPARγ可抑制炎性趨化物S100A8/A9 mRNA的表達(dá)。激活PPARγ本身有促分化特性[2]。巨噬細(xì)胞分化成熟后S100A8 mRNA和S100A9 mRNA不再表達(dá)[7]，吡格列酮抑制 S100A8 mRNA和S100A9 mRNA表達(dá)提示其具有促巨噬細(xì)胞分化成熟的作用。文獻(xiàn)表明，成熟的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)明顯減弱，可能是導(dǎo)致某些急性炎癥反應(yīng)自發(fā)緩解重要機制[8]。本小組研究曾發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可能通過促巨噬細(xì)胞成熟而減輕痛風(fēng)性炎癥[9]。RA滑膜炎癥持續(xù)放大而不能自發(fā)緩解，提示巨噬細(xì)胞功能可能存在異常。本文初步探討了PPARγ激活后對CIA滑膜S100A8/A9 mRNA表達(dá)的影響，意在為進(jìn)一步的研究建立基礎(chǔ)，深入研究PPARγ、S100A8/A9 mRNA以及巨噬細(xì)胞分化在RA中的作用，可深化對RA發(fā)病機制的認(rèn)識，為RA治療新藥研究提供新的思路。

總之，PPARγ激動劑吡格列酮可明顯抑制RA模型滑膜S100A8/A9 mRNA的基因表達(dá)，其改善RA炎癥的機制可能涉及對巨噬細(xì)胞分化的調(diào)控。人類RA病程與巨噬細(xì)胞的分化的關(guān)系、如何更有效改善滑膜巨噬細(xì)胞功能以及PPARγ激活后如何實現(xiàn)對S100A8/A9 mRNA的內(nèi)在調(diào)控作用則是需要我們深入認(rèn)識的新領(lǐng)域。

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