吳 曉，陳 蕾，莊軼軒，陳炯玉，洪超群，奚少彥，張 灝

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤，居惡性腫瘤死亡率的第2位。其5年總生存率僅為15%～35%。和其他惡性腫瘤一樣，胃癌患者引起死亡的主要原因是轉(zhuǎn)移及侵襲。引起胃癌發(fā)生、發(fā)展的因素很多，生長因子及其受體信號途徑尤受關(guān)注。人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)為人類表皮生長因子受體家族成員之一。HER2蛋白具有酪氨酸激酶活性，在與其他受體結(jié)合后，通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化和增殖。已有報(bào)道顯示HER2蛋白的過表達(dá)和(或)基因擴(kuò)增與胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[1]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是腫瘤的促血管生成因子之一，其過度表達(dá)與腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[2]。Saito等[3]研究甚至提示VEGF是胃癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。為了進(jìn)一步探討這兩者的表達(dá)與胃癌的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，利用免疫組化(immunohistochemistry，IHC)的方法與熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)的方法檢測了103例胃癌患者術(shù)后標(biāo)本中HER2的表達(dá)與擴(kuò)增間的關(guān)系，利用IHC的方法檢測VEGF在胃癌中的表達(dá)狀態(tài)，并分析兩者的表達(dá)與胃癌臨床病理因素之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織 收集中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2011年胃癌根治性手術(shù)標(biāo)本103例，術(shù)前均未進(jìn)行放化療。按國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)腫瘤臨床分期(tumor node metastasis，TNM)，Ⅰ期15例，Ⅱ期16例，Ⅲ期59例，Ⅳ期13例，其中管狀腺癌91例、印戒細(xì)胞癌12例;女性39例、男性64例，平均年齡55.6(23～79)歲;位于賁門部的腫瘤7例，其余臨床病理指標(biāo)見表1。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人HER2單克隆抗體與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記通用性EnVision試劑盒購自丹麥DAKO公司，兔抗人VEGF單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;HER2探針購于北京金菩嘉公司。

1.2 方法

1.2.1 IHC染色 標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛緩沖固定液，石蠟包埋，4 μm厚切片，pH 8.0乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原熱修復(fù)，EnVision二步法染色。HER2、VEGF抗體為1∶200，按說明書進(jìn)行染色，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木精對比染色，透明封固，陽性對照及陰性對照由試劑公司提供。

1.2.2 IHC結(jié)果判定 HER2的結(jié)果判斷，陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜，為棕黃色顆粒。細(xì)胞膜均無染色或≤10%腫瘤細(xì)胞膜染色者結(jié)果為“0”(陰性);腫瘤細(xì)胞＞10%，細(xì)胞膜不完整，弱染色者結(jié)果為“+”(陰性);腫瘤細(xì)胞＞10%，細(xì)胞膜基底膜和側(cè)膜輕度至中度完整，染色者結(jié)果為“++”(不確定);腫瘤細(xì)胞＞10%，細(xì)胞膜基底膜和側(cè)膜完整，強(qiáng)染色者結(jié)果為“+++”(陽性)。

VEGF的結(jié)果判斷，陽性定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)與胞膜染色，為棕黃色顆粒，采用3個(gè)參數(shù)(即染色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞數(shù)和兩者記分的乘積)的半定量的計(jì)數(shù)方法。著色強(qiáng)度記分標(biāo)準(zhǔn):無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞的陽性細(xì)胞百分率，記分標(biāo)準(zhǔn):無染色為0分，1%～10%為1分，11%～25%為2分，26%～50%為3分，＞50%為4分。染色強(qiáng)度記分與陽性細(xì)胞數(shù)記分之積為最后得分，1～3分為陰性，＞3分為陽性染色。

1.2.3 FISH方法 具體步驟:厚度3～5 μm的切片經(jīng)二甲苯脫蠟、復(fù)水、沸水浴30 min;200 μg/ml蛋白酶K 37℃作用20～40 min;10%中性福爾馬林固定10 min，梯度乙醇脫水;加入10 μl探針混合液，83℃變性5 min，42℃過夜雜交。經(jīng)2×SSC(氯化鈉300 mmol/L、檸模酸鈉30 mmol/L)46℃ 5 min，0.1%乙基苯基聚乙二醇(nonyl phenoxy polyethoxy ethanol，NP)-40/2 ×SSC 46℃ 5 min，70%乙醇3 min洗片，干燥后，室溫下將15 μl 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復(fù)染劑滴加于玻片雜交區(qū)域，立即蓋上蓋玻片，15 min后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 FISH結(jié)果判斷 由專門受過培訓(xùn)的病理醫(yī)師在熒光顯微鏡下判斷，計(jì)數(shù)30個(gè)腫瘤細(xì)胞的紅、綠信號數(shù)，當(dāng)Ratio＜1.8為陰性結(jié)果，提示該樣本無HER2基因擴(kuò)增;Ratio在1.8～2.2之間時(shí)，增加細(xì)胞計(jì)數(shù)至100個(gè)腫瘤細(xì)胞或重做FISH實(shí)驗(yàn)來判斷最終結(jié)果;Ratio＞2.2為陽性結(jié)果，提示HER2基因擴(kuò)增;當(dāng)紅色信號呈簇狀擴(kuò)增時(shí)，無論綠色信號為多少，都記為陽性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。率比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，小樣本資料選用Fisher精確檢驗(yàn)法，指標(biāo)間的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HER2在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 IHC顯示HER2在胃癌的中陽性表達(dá)，位細(xì)胞膜上(圖1)。用IHC的方法，HER2在胃癌中的蛋白表達(dá)，103例標(biāo)本中，陽性表達(dá)(+++)為10例(9.8%)、不確定陽性(++)為4例(3.8%)、陰性(0和+)為89例(86.4%)，且所有陽性和不確定陽性病例的病理分型均為管狀腺癌。

圖1 胃癌組織中HER2蛋白表達(dá)(EnVision法，×400)

FISH顯示當(dāng)Ratio＞2.2或當(dāng)紅色信號呈簇狀擴(kuò)增時(shí)，提示HER2擴(kuò)增，在胃癌中陽性表達(dá)(圖2)。將IHC顯示為陽性及不確定陽性的病例共14例重新通過FISH校正，結(jié)果顯示10例陽性病例中有9例擴(kuò)增，4例不確定陽性病例中有2例擴(kuò)增。在陽性病例中IHC與FISH的符合率為90%，有良好的相關(guān)性(P＜0.01)。HER2的擴(kuò)增(過表達(dá))明顯與胃癌的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及Lauren分型相關(guān)(P ＜0.05，表1)。

圖2 胃癌組織中HER2蛋白表達(dá)(FISH法)

2.2 VEGF在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 胃癌組織中VEGF主要陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(圖3)。大部分胃癌細(xì)胞存在不同程度的染色，評分在1～12分之間，其中46例在1～3分之間，25例在4～12分之間。VEGF在胃癌的表達(dá)陽性率約為24%(25/103)。VEGF的陽性表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、病理分級、Lauren分型相關(guān)(P＜0.05，表1)。雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上未發(fā)現(xiàn)VEGF與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及腫瘤的大小存在顯著相關(guān)性，但從表1中可以看出隨著腫瘤的進(jìn)展，VEGF的表達(dá)率是上升的。

圖3 胃癌組織中VEGF蛋白表達(dá)(EnVision法×400)

表1 103例中HER2及VEGF與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 HER2與VEGF在胃癌中的表達(dá)關(guān)系 本組103例胃癌組織中，HER2與VEGF同時(shí)陽性表達(dá)4例，同時(shí)陰性表達(dá)71例，統(tǒng)計(jì)學(xué)上未發(fā)現(xiàn)兩者有相關(guān)性(P ＞0.05，表 2)。

表2 103例中HER-2與VEGF在胃癌中的表達(dá)關(guān)系

3 討論

HER2基因定位于人染色體17q21，編碼由1 225個(gè)氨基酸組成的跨膜糖蛋白(p185)，相對分子質(zhì)量為185×103，包含N末端胞外黏合區(qū)、跨膜區(qū)和具有酪氨酸激酶活性的C末端胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分[4]。HER2蛋白具有酪氨酸激酶活性，可通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖與分化。多項(xiàng)研究表明HER2過表達(dá)與腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)[5-6]，同時(shí)HER2擴(kuò)增(過表達(dá))是應(yīng)用分子靶向藥物曲妥珠單抗治療的指征。在本研究中，胃癌HER2的擴(kuò)增率約為11%(11/103)，且與腫瘤的分化程度高度相關(guān)，中分化癌HER2的擴(kuò)增率明顯高于低分化癌(P＜0.05)，在腸型胃癌中的擴(kuò)增率明顯高于彌漫型，印戒細(xì)胞癌中未見HER2的擴(kuò)增(過表達(dá));同時(shí)，HER2的擴(kuò)增率在淋巴結(jié)陽性組明顯高于淋巴結(jié)陰性組。這提示HER2與分化較好的胃管狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，與Yu等[7]的研究一致。在胃癌中特別是管狀腺癌中，檢測HER2的狀態(tài)有明確的臨床意義。本研究同時(shí)表明，用FISH檢測HER2基因擴(kuò)增和應(yīng)用IHC檢測HER2蛋白過表達(dá)結(jié)果之間有極好的相關(guān)性，與劉學(xué)政等[8]的報(bào)道一致。HER2基因的擴(kuò)增是HER2蛋白過表達(dá)的主要機(jī)制[9]，由于IHC操作簡便、費(fèi)用低廉，適于初篩。FISH的敏感性和特異性較高，有標(biāo)準(zhǔn)化陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行定量分析。對于IHC HER2檢測為不確定陽性(++)的患者建議做FISH檢測，以確定有無HER2基因的擴(kuò)增來指導(dǎo)臨床應(yīng)用靶向藥物。

VEGF基因定位于染色體6p21.3，是一個(gè)相對分子質(zhì)量為(34～45)×103的高度糖基化堿性蛋白，是由相對分子質(zhì)量為(17～22)×103的同源雙聚體所構(gòu)成。VEGF在體內(nèi)能特異性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂，增加毛細(xì)血管的通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)血管的生成。在腫瘤中，其表達(dá)與腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌VEGF陽性患者較陰性患者的預(yù)后更差[10-11]。VEGF陽性是胃腸道腫瘤應(yīng)用分子靶向藥貝伐單抗的指征。本研究IHC顯示，大部分胃癌細(xì)胞均存在不同程度的染色，評分在1～12分之間，陽性表達(dá)主要在分化較好的管狀腺癌，浸潤較深的腫瘤表達(dá)率明顯高于浸潤較淺的腫瘤，這表明VEGF參與了分化較好的胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

在本組研究中，未發(fā)現(xiàn)HER2的擴(kuò)增與VEGF的表達(dá)存在相關(guān)性。Yamashita-Kashima等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)，在胃癌治療中VEGF的陽性表達(dá)是應(yīng)用靶向藥貝伐單抗的分子指征，同時(shí)貝伐單抗的敏感性并沒有與HER2的狀態(tài)相關(guān)。這提示了HER2與VEGF雖然都參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，同樣是靶向治療的靶點(diǎn)，但它們作用于胃癌的分子通路可能是不一致的。綜上所述，聯(lián)合檢測HER2及VEGF在胃癌(特別是腸型胃癌)中的狀態(tài)有助于了解胃癌的發(fā)生、發(fā)展及靶向藥物曲妥珠單抗和貝伐單抗的選擇。對進(jìn)一步深入研究胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，探索更多新的藥物靶點(diǎn)，對胃癌進(jìn)行個(gè)體化治療具有重要意義[13]。

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