程 亮，俞偉男，胡 文，柏 鳳，郝海榮

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎臟疾病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因之一。以往的研究認為腎小球細胞外基質(zhì)的堆積、系膜增生、基底膜增厚是DN的主要病理特征。近年來的研究認為足細胞是腎小球濾過屏障通透性改變和蛋白尿發(fā)生過程中的關(guān)鍵細胞[1]。Nephrin是足細胞裂孔隔膜上重要的功能蛋白分子。既往的動物實驗研究結(jié)果顯示足細胞表面nephrin蛋白的表達異常與蛋白尿的產(chǎn)生以及DN的病情進展相關(guān)，并且在DN早期大鼠尿液中即可檢測到nephrin蛋白[2]。本研究通過檢測不同DN患者尿液中nephrin水平，探討尿nephrin表達在DN患者中的意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 病例來源于2010年10月－2011年10月在徐州醫(yī)學(xué)院附屬淮安市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的2型DM患者，共90例，男性45例、女性45例，年齡(52.31±8.65)歲，均符合1999年WHO制定的DM診斷和分型標準;正常對照組20例(NC組)，男性9例、女性11例，年齡(50.69±7.52)歲，為本院健康體檢者，無心、肝、腎疾患。根據(jù)Mogenson分型標準，按照24 h尿白蛋白排泄率(urine albumin excretion rate，UAER)結(jié)果將 90 例DM患者分為:無白蛋白尿組30例(DM組)，UAER＜20 μg/min;微量白蛋白尿組32 例(DN1 組)，20 μg/min≤UAER＜200 μg/min;大量白蛋白尿組28例(DN2 組)，UAER≥200 μg/min。排除標準:年齡在18歲以下或70歲以上者;妊娠或哺乳期婦女;近1個月內(nèi)有糖尿病酮癥、肝膽或泌尿系感染以及其他嚴重感染患者;嚴重心腦血管疾病、腫瘤、外傷、風(fēng)濕性疾病、腎動脈狹窄和其他可能腎臟疾病患者。各組間年齡、性別構(gòu)成比經(jīng)過均衡性檢驗，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.1.2 主要試劑 Nephrin定量酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒為美國R＆D System公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 所有入組患者留取晨尿10 ml，2 000 r/min離心5 min，收集上清液，－20℃保存?zhèn)溆?，用于尿nephrin定量測定。

1.2.2 尿nephrin檢測 將nephrin單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的nephrin與單抗結(jié)合，加入酶標抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，加入酶底物 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB)，出現(xiàn)藍色，加終止液，顏色變黃，用酶標檢測儀在450 nm處測定吸光度，nephrin濃度與吸光度成正比，可求出樣品中待測蛋白濃度。為了消除尿量的影響，尿nephrin質(zhì)量分數(shù)以尿nephrin/尿肌酐(μg/mg)來表示，并分析尿 nephrin與β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)、尿 N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D glucosaminidase，NAG)和UAER的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。正常對照組與DM患者各組各項指標的比較采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗，DM患者各組之間的比較采用單因素方差分析;相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入選研究對象的基本資料 入選的90例DM患者及正常對照組20例基本情況見表1。各組間年齡、性別構(gòu)成無統(tǒng)計學(xué)差異。DM組、DN1組、DN2組患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、β2-MG、尿NAG、UAER和尿 nephrin/尿肌酐比值與 NC組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表1 DM患者各組與正常對照組資料

表2 DM患者各組與正常對照組的尿足細胞相關(guān)指標

2.2 DN患者尿nephrin排泄特征 NC組患者尿液中未檢測到nephrin蛋白;DM組患者尿中可檢測到少量nephrin蛋白，尿nephrin/尿肌酐為(9.42±2.95)μg/mg;DN1組患者尿nephrin排泄較DM組明顯增加，尿nephrin/尿肌酐為(29.51±8.40)μg/mg;DN2組患者尿 nephrin排泄進一步增加，尿nephrin/尿肌酐為(59.48±11.98)μg/mg。DM 組、DN1組、DN2組組間尿nephrin/尿肌酐比值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

Spearman法相關(guān)分析顯示，入選90例DM患者尿nephrin/尿肌酐比值與血肌酐、尿素氮、β2-MG、尿NAG、UAER均呈正相關(guān)(P＜0.05，表3)。

表3 DM患者各組尿nephrin/尿肌酐比值與Scr、BUN、β2-MG、尿 NAG、UAER 之間的相關(guān)性

3 討論

足細胞是腎小球中一種高度特異、終末分化的細胞，與腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)和毛細血管內(nèi)皮細胞一起構(gòu)成腎小球濾過膜。足細胞結(jié)構(gòu)可分為細胞體、主突、足突3個部分，相鄰足細胞的足突由裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)相連，構(gòu)成一種拉鏈式結(jié)構(gòu)，可阻止蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的濾過。Nephrin是位于足細胞之間SD上的一種跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族，特異性表達于 SD上。Nephrin與 podocin、CD2AP相互作用形成復(fù)合體，將SD固定于足細胞的細胞骨架上，參與足細胞內(nèi)外信號的傳遞過程。Nephrin結(jié)構(gòu)中含有10個潛在的糖基化位點，可與帶負電荷的糖基化產(chǎn)物結(jié)合，形成腎小球濾過膜的電荷屏障[3]。各種炎癥和非炎癥損傷引起足細胞表面nephrin表達異常，細胞外向細胞內(nèi)骨架蛋白的信號傳遞發(fā)生障礙，足細胞骨架蛋白排列紊亂，足細胞的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，與GBM的黏附作用減弱，從GBM剝離、脫落，腎小球正常濾過屏障功能受損，最終導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生[4]。既往的研究發(fā)現(xiàn)，nephrin的分布和表達異常與多種先天性及獲得性蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)。近年來有研究證實nephrin蛋白異常表達也與DN蛋白尿的發(fā)生有關(guān)[5]。Welsh等[3]發(fā)現(xiàn)在DN早期腎小球肥大，足細胞代償性合成功能增加，nephrin基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達增加;隨著DN病情的進展，腎小球濾過率逐漸升高，足細胞的骨架蛋白重新分布，nephrin蛋白可從足細胞脫落隨尿液排出體外。Zhang等[6]研究證實，在正常大鼠尿液中未發(fā)現(xiàn)nephrin排泄，而鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠造模早期尿液中即可檢測到nephrin蛋白，隨著DN病情進展，大鼠尿nephrin排泄逐漸增多，尿nephrin排泄與糖尿病腎病的病情進展呈正相關(guān)。Doublier等[7]研究發(fā)現(xiàn)，DN患者早期足細胞表面nephrin蛋白表達代償性增加，足細胞骨架蛋白的重新分布引起nephrin蛋白與足細胞骨架蛋白解離，nephrin蛋白脫落隨尿液排出體外，尿nephrin蛋白排泄增多;DN發(fā)展到晚期足細胞表面nephrin蛋白表達受抑制，尿nephrin蛋白排泄將有所下降。

本研究通過應(yīng)用生物素-親和素標記抗體-ELISA法測定DM患者尿液中nephrin蛋白的排泄，探討尿nephrin檢測在DM患者中的意義。實驗中NC組尿液中未檢測到nephrin蛋白，DM組尿液中檢測到少量nephrin蛋白，DN1組尿中nephrin蛋白排泄明顯增加，DN2組尿nephrin排泄進一步增加。而nephrin特異性表達于足細胞的SD上，提示尿nephrin可反映DM患者早期足細胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著DN病情的進展，尿nephrin排泄有逐漸增多的趨勢，尿nephrin/尿肌酐比值與尿NAG和β2-MG相關(guān)分析顯示，尿nephrin/尿肌酐比值與尿NAG 呈正相關(guān)(r=0.80，P ＜0.01)，尿 nephrin/尿肌酐比值與β2-MG呈正相關(guān)(r=0.71，P＜0.01)，而尿NAG和β2-MG均是反應(yīng)腎功能早期改變的敏感指標[9]，提示尿nephrin蛋白檢測有可能成為一種無創(chuàng)性的監(jiān)測DN患者早期腎臟損傷的指標。將尿nephrin/尿肌酐比值與UAER做相關(guān)分析，結(jié)果顯示尿nephrin/尿肌酐比值與UAER呈正相關(guān)(r=0.87，P＜0.01)，提示尿nephrin蛋白隨著尿白蛋白排泄的增加而增加。尿白蛋白排泄率是目前公認的DN診斷和分型指標，可反映DN的腎臟病變進展，由此推測尿nephrin蛋白的變化可反映DN的腎臟病變進展。

綜上所述，尿nephrin可能成為監(jiān)測DM患者早期腎臟損傷的一種無創(chuàng)性指標，對于發(fā)現(xiàn)早期糖尿病腎病、評估DN的病情進展和指導(dǎo)臨床治療有著重要的意義。

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