代麗婷， 劉 東， 張艷菊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

‘東農(nóng)冬麥1號’是在黑龍江省冬季嚴(yán)寒條件下，利用品種間雜交育成的超強(qiáng)冬性抗寒新品種，已實(shí)現(xiàn)在黑龍江一些地區(qū)穩(wěn)定安全越冬，打破了冬小麥不能在黑龍江播種的歷史，改寫了黑龍江省傳統(tǒng)的一年一熟的種植制度。冬小麥具有生育期長、產(chǎn)量潛力高和提早成熟等特點(diǎn)，在黑龍江省冬麥秋播既緩解了農(nóng)時，解決了春澇播不上種的問題，又可以有效提高黑龍江省小麥單產(chǎn)水平，實(shí)現(xiàn)黑龍江省部分地區(qū)兩年三熟種植，提高土地利用效率，對黑龍江省種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整具有深遠(yuǎn)意義［1］。但是，隨著冬小麥在黑龍江省種植面積的擴(kuò)大，一些植物病害的發(fā)生給冬小麥的生產(chǎn)造成了一定影響，其中雪腐病就是危害冬小麥生產(chǎn)的重要病害之一。在冬末春初，冬小麥剛返青時，積雪較多的地區(qū)由于雪腐病的發(fā)生，造成麥苗成條成塊枯萎，死亡率極高，直接影響產(chǎn)量。2011年4月，作者在黑龍江省饒河縣冬小麥種植區(qū)發(fā)現(xiàn)有苗枯的癥狀發(fā)生，冬麥苗成條成塊枯萎死亡，病苗生長衰弱，根系不發(fā)達(dá)或短，苗矮，發(fā)病重時整株呈水浸狀變褐腐爛或死亡，發(fā)病率為10%～30%，嚴(yán)重的可達(dá)50%。作者在發(fā)生上述癥狀的冬小麥田采集病樣，進(jìn)行了病菌的分離、鑒定以及生物學(xué)特性研究，以期為病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

從黑龍江省饒河縣青山村采集冬小麥病樣，采用常規(guī)組織分離法［2］進(jìn)行分離。剪取5mm×5mm病健交界處葉片，先在75%乙醇中浸8～10s，再用0.1%升汞溶液消毒30s，滅菌水沖洗3～4次后，用滅菌濾紙吸干水分，置于含有鏈霉素的PDA、PSA培養(yǎng)基中，15℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。單孢純化后保存于PDA斜面上備用。

1.2 病原鑒定

1.2.1 病原菌的形態(tài)觀察

挑取經(jīng)單孢純化后的菌絲，分別接種于PSA和SNA兩種培養(yǎng)基上，25℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)12h光照與黑暗交替培養(yǎng)，記錄在PSA上培養(yǎng)4d和7d的菌落直徑大小，顏色變化；大、小型分生孢子和厚垣孢子的有無及大小、形狀和著生方式等情況。參考Booth（1971）、Nelson（1983）、Leslie ＆ Summerell（2006）［3－5］等資料及真菌鑒定手冊［6］進(jìn)行鑒定。

1.2.2 致病性測定

冬小麥品種‘東農(nóng)冬麥1號’播種于25cm×40cm播種盤內(nèi)，25℃光暗交替培養(yǎng)至2～3片葉時采用噴霧法進(jìn)行接種。將單孢分離的菌株移入PL培養(yǎng)液（馬鈴薯200g，乳糖20g，蒸餾水1 000mL）內(nèi)，振蕩培養(yǎng)7d后，配制成孢子含量4×106個／mL的菌懸液接種體，均勻噴霧于小麥葉片上。接種后置于18℃、12h8 000～10 000lx光暗交替培養(yǎng)，套袋保濕3d，7d后調(diào)查發(fā)病情況。以接種無菌水為對照。按照柯赫氏法則，從接種后發(fā)病的植株上再進(jìn)行病原菌分離以及再次接種，以確定分離物是否為致病菌。

1.3 病原菌生物學(xué)特性

1.3.1 溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，分別于5、10、15、20、25、30℃條件下光暗交替培養(yǎng)，7d后測量菌落直徑，每個處理3次重復(fù)。10d后測產(chǎn)孢量：每皿倒入等量無菌水，刮下菌落，用紗布過濾，濾液在1 500r／min的離心機(jī)上離心20min，倒去上清液，沉淀物用10mL無菌水稀釋，計(jì)算產(chǎn)孢量［2］。用新復(fù)極差法 （Duncan法）進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3.2 病原菌致死溫度的測定

菌餅置于滅菌離心管底部，分別于35、40、45、50、55、60、65℃處理10min，然后置于PDA平板中央，每處理3次重復(fù)，25℃培養(yǎng)5d，觀察菌絲在PDA平板的生長情況［7］。

1.3.3 光照對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

將菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于全光照、12h光暗交替、全黑暗，25℃條件下培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次。7d后測量菌落直徑，觀察氣生菌絲及菌落的形態(tài)和顏色。10d后測產(chǎn)孢量（方法同1.3.1）。

1.3.4 pH對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

用1mol／L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)配制pH為2.5、3.5、5.0、6.0、7.0、9.0、10.5、11.5的 PDA 培養(yǎng)基，將菌餅移植于PDA平板中央，25℃光暗交替培養(yǎng)，7d后測量菌落直徑，每個處理3次重復(fù)。10d后測產(chǎn)孢量（方法同1.3.1）。

1.3.5 營養(yǎng)成分對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用查彼克（Czapek）培養(yǎng)基：NaNO32g、KCl 0.5g、FeSO40.01g、K2HPO41.0g、MgSO40.5g、蔗糖30g、瓊脂17g。碳源用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉替代培養(yǎng)基中的蔗糖；氮源用 NH4NO3、KNO3、（NH4）2SO4、牛肉膏、蛋白胨替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的NaNO3。將菌餅移植于上述培養(yǎng)基中，25℃光暗交替培養(yǎng)，7d后測菌落直徑，觀察氣生菌絲及菌落的形態(tài)和顏色［8］。10d后測產(chǎn)孢量。

1.3.6 礦質(zhì)營養(yǎng)元素對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

完全培養(yǎng)液為蔗糖10g，50%NH4NO36mL，KH2PO40.51g，MgSO40.75g，F(xiàn)eSO40.015g。缺N用0.17g NaCl代替完全培養(yǎng)液中的NH4NO3；缺C用0.17g NaCl代替蔗糖；缺P用0.255g KCl代替 KH2PO4；缺 Fe用 0.015g NaSO4代替FeSO4；缺 K用0.51g NaH2PO4代替 KH2PO4；缺Mg用0.75g Na2SO4代替MgSO4。上述營養(yǎng)液每100mL加入1.8g瓊脂粉配成固體培養(yǎng)基。菌餅移植于上述培養(yǎng)基平板中央，25℃恒溫光暗交替培養(yǎng)，7d后測量菌落直徑，觀察氣生菌絲及菌落的形態(tài)和顏色［9］。10d后測產(chǎn)孢量。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

雪腐病主要發(fā)生在連作地塊，在積雪融化時癥狀最明顯。重的地塊冬麥苗成條成塊的枯萎死亡（圖1a）。發(fā)病植株葉片染病初呈水浸狀，后擴(kuò)展為橢圓形至圓形大斑。發(fā)生在葉緣的多呈半圓形，大小1～4cm，邊緣灰色，葉間污褐色，呈浸潤性地向四周擴(kuò)展，形成不十分明顯的輪紋數(shù)層，病斑上可見磚紅色霉?fàn)钗铮▓D1b）。濕度大時病斑邊緣現(xiàn)白色菌絲層。病苗基部的葉鞘變褐壞死，且向葉片基部發(fā)展，致整葉變褐或變黃枯死。病苗生長衰弱，根系不發(fā)達(dá)或短，苗矮，第1、2葉短縮，發(fā)病重時整株呈水浸狀變褐腐爛或死亡，死苗倒伏，表面生白色菌絲。

圖1 小麥雪腐病發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of the winter wheat snow mold

2.2 病原鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)特征

在PSA培養(yǎng)基25℃光暗交替條件下，48h菌落直徑為16.5mm。剛長出的菌絲為白色，后在培養(yǎng)基上菌落依菌株不同有橙黃色、粉紅色或杏仁黃（圖2）。在光暗交替條件下，菌落形成同心環(huán)，邊緣整齊，菌絲體稀疏或致密，向上生長呈羊毛狀或平鋪生長呈氈狀，在培養(yǎng)基表面生成大量橘黃色黏分生孢子團(tuán)，氣生菌絲亦能產(chǎn)孢。培養(yǎng)5d后在顯微鏡下觀察小型分生孢子數(shù)量不多，長橢圓形、卵形或腎形，無色（圖3a）；大型分生孢子新月形，兩端鈍圓，無腳胞，無色，具隔膜0～3個，有時較多4～7個，以1個和3個隔膜居多，無隔膜的大?。?.3～12.8）μm×（2.0～2.8）μm，1個的（10.3～17.8）μm×（2.3～3.3）μm，2～3個的（15.3～30.8）μm×（2.3～3.8）μm，4～7個的（19.3～37.8）μm×（2.5～4.0）μm（圖3b～g）；分生孢子梗短而直，無隔，棍棒狀，大?。?.0～11.0）μm×（3.0～5.0）μm；產(chǎn)孢細(xì)胞瓶狀或倒梨形，端部較長，有環(huán)痕，大小（7.0～10.0）μm×（2.5～4.0）μm。

圖2 小麥雪腐病病菌菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of the winter wheat snow mold

圖3 小麥雪腐病病菌形態(tài)Fig.3 Morphology of the pathogen causing the winter wheat snow mold

2.2.2 致病性測定

盆栽接種試驗(yàn)顯示，在18℃培養(yǎng)7d后，幼葉上可見紡錘形或橢圓形病斑，病斑中央淡褐色，邊緣紅色，直徑2.0～3.0mm，有的呈水漬狀斑點(diǎn)，后期嚴(yán)重發(fā)病的葉片枯黃死亡，死亡葉片多由葉鞘和葉片基部發(fā)病，迅速擴(kuò)展使整個葉片褐腐或變黃枯死?？菟廊~片表面有白色菌絲蔓延，使葉片與葉片之間相互連接。有的葉片上產(chǎn)生粉紅色分生孢子，后期死葉成粉紅色。發(fā)病癥狀與田間癥狀一致，從接種發(fā)病的植株病部可重新分離獲得病原菌，并與所接種的病原菌一致，再次接種得到相同的結(jié)果，因此確定此病原菌為致病菌。

2.3 病原菌生物學(xué)特性

2.3.1 溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

溫度對病原菌的生長具有顯著的影響。在5～30℃條件下菌株均能夠生長，在20～25℃時菌絲生長較快，顯著地高于其他的溫度處理。根據(jù)觀察，第7天時25℃菌絲生長最快，之后20℃比25℃的菌絲生長速率快。圖4為培養(yǎng)7d的菌落直徑，從圖中可以看出，菌絲生長最適溫度為20～25℃，其他4個溫度處理沒有顯著性差異，但30℃菌絲出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象。

10～25℃范圍內(nèi)病原菌可以產(chǎn)孢，其中最適宜的產(chǎn)孢溫度為15℃，培養(yǎng)10d產(chǎn)孢量達(dá)到4.0×106個／mL。5℃和30℃時病原菌均不產(chǎn)孢（圖4）。

圖4 溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Effects of temperature on mycelial growth and spore production of the winter wheat snow mold

2.3.2 病原菌致死溫度的測定

病菌在35、40℃和45℃范圍內(nèi)水浴10min，在恒溫箱中培養(yǎng)5d后，在培養(yǎng)基上均有菌落形成，直徑分別達(dá)到44、30、25mm；50℃以上的條件下在培養(yǎng)基上均沒有菌落形成，病原菌的致死溫度為50℃水浴10min。

2.3.3 光照對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

在光暗交替（L∥D＝12h∥12h）的條件下，病原菌菌絲生長最快，培養(yǎng)7d后，菌落直徑達(dá)到61mm，產(chǎn)孢量也最高，為5.0×106個／mL，菌落呈鮮粉紅色，氣生菌絲致密；在全黑暗條件下，菌絲生長最慢，7d后菌落直徑為50mm，產(chǎn)孢量最低，為2.5×105個／mL，菌落呈暗粉色，氣生菌絲致密。但3個處理間菌絲生長沒有顯著性差異，而產(chǎn)孢量差異顯著（圖5）。

圖5 光照對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effects of light on mycelial growth and spore production of the winter wheat snow mold

2.3.4 pH對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

菌絲在pH 2.5～11.5均能夠生長，但菌絲在pH 2.5時生長緩慢；pH 3.5～11.5范圍內(nèi)菌落直徑?jīng)]有顯著性差異，pH為7時菌絲生長最快，培養(yǎng)7d后，菌落直徑達(dá)到40mm。病原菌在pH為5～10.5范圍內(nèi)能夠產(chǎn)孢，產(chǎn)孢的最適pH為6～7，在pH為7時產(chǎn)孢量最大，為3.7×106個／mL（圖6）。

圖6 pH對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.6 Effects of pH on mycelial growth and spore production of the winter wheat snow mold

2.3.5 碳源對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

病菌在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，在甘油和麥芽糖上生長較慢，生長量的大小依次為：淀粉＞蔗糖＞葡萄糖＞乳糖＞麥芽糖＞甘油。雖然病菌在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長相對較慢，但產(chǎn)孢最多，為3.6×106個／mL，產(chǎn)孢量最少的為乳糖，為1.3×106個／mL，方差分析表明，不同碳源對產(chǎn)孢量的影響差異顯著（圖7）。不同碳源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)均屬于致密型。

圖7 不同碳源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.7 Effects of different carbon sources on mycelial growth and spore production of the winter wheat snow mold

2.3.6 氮源對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

病菌在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基上生長最快，顯著高于其他處理，而在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上最慢，其他4個處理差異不十分顯著；在以硝酸鈉為氮源的Czapek培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多，為2.8×106個／mL，在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢（圖8）。不同氮源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)不同，有蛋白胨的培養(yǎng)基菌落較稀疏，有牛肉膏的培養(yǎng)基菌落稀疏，其他均屬于致密型。

圖8 不同氮源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.8 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth and spore production of the winter wheat snow mold

2.3.7 礦質(zhì)營養(yǎng)元素對菌絲生長的影響

病菌在完全營養(yǎng)液中生長最好，第7天菌落直徑達(dá)到37mm，顯著高于其他處理；缺P、Mg的處理次之，在缺N、C的處理中生長最慢，說明缺N、C對病菌菌絲生長影響較大（圖9）。在這7個處理中病菌都沒有產(chǎn)生孢子。缺N、缺C和缺P的培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)稀疏，其他均屬于致密型。

圖9 礦質(zhì)營養(yǎng)對菌絲生長的影響Fig.9 Effects of mineral nutrients on mycelial growth of the winter wheat snow mold

3 結(jié)論與討論

本文根據(jù)病菌形態(tài)特征和致病性分析，將黑龍江省饒河縣采集的小麥雪腐病鑒定為半知菌亞門雪腐格氏霉Gerlachia nivale （Ces.ex Sacc.）W.Gams.et E.Mull.［異名 Fusarium nivale （Fr.）Ces.或 Microdochium nivale（Fr.）Samuels ＆ Hallet］，有性世代為雪腐小畫線殼［Monographella nivalis （Schaffn.）Mull.］侵染引起的紅色雪腐病。小麥雪腐（霉）?。╳heat snow molds）又名雪霉葉枯病、雪腐葉枯病［10］，是由多種耐低溫病原菌侵染引起、危害小麥幼苗、導(dǎo)致苗腐的一類病害。雪腐病菌是一類菌的名字，它包括不同分類單位的真菌，包括藻界卵菌綱的Pythium iwayamai Ito、P.okanoganense Lipps、P.paddicum Harane；子囊菌亞門的 Microdochium nivale （teleomorph：Monographella nivalis，syn.Fusarium nivale）、Phacidium infestans、Racodium therryanum、Sclerotinia borealis （syn.Myriosclerotinia borealis）、S.nivalis、S.trifoliorum、S.kitajimana；擔(dān)子菌亞門的 Coprinus psychromorbidus、Typhula incarnata、T.ishikariensis（syn.T.idahoensis）和半知菌亞門的Gerlachia nivalis［11］。紅色雪腐病和雪霉葉枯病是同一種病原菌在不同生態(tài)條件和在寄主不同生育階段引起的兩種癥狀類型［12］。此病自1972年以來在墨西哥、英國、日本、朝鮮等國就已經(jīng)報道發(fā)生［13－16］，在國內(nèi)最早于1961年在陜西發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)80年代初才正式報道，迄今在青海、甘肅、新疆、四川、貴州、湖北和江蘇、浙江等省都有發(fā)生［17］，新疆北部發(fā)生較多［18］，在黑龍江省是新發(fā)生的一種病害，尚屬首次報道。

病菌生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，菌絲生長的最適宜溫度為20～25℃，最適pH為7，在光暗交替（L∥D＝12h∥12h）條件下，菌絲生長最快；最適碳源為淀粉，最適氮源為牛肉膏，在完全營養(yǎng)液中生長最好，缺N、C對病菌生長影響較大，該結(jié)果與1986年舒正義報道過的關(guān)于雪霉葉枯病菌的礦質(zhì)營養(yǎng)的研究基本一致［9］；病菌的致死溫度為50℃10min。

病菌最適宜的產(chǎn)孢溫度為15℃，5℃和30℃時均不產(chǎn)孢；產(chǎn)孢的最適pH為6～7，pH為7時產(chǎn)孢量最大；光暗交替的條件有利于產(chǎn)孢；在以麥芽糖為碳源、硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上有利于產(chǎn)孢。

本文通過對黑龍江省冬小麥雪腐病病原種類的鑒定以及病菌生物學(xué)特性的研究，為闡明病菌生長與環(huán)境條件的關(guān)系，進(jìn)一步明確雪腐病在黑龍江省的發(fā)生規(guī)律以及病害綜合防治提供一定的理論依據(jù)。

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