蔡吉林， 束長龍， 宋福平， 黃 勃， 張 杰＊

（1.安徽省微生物防治省重點實驗室，安徽農業(yè)大學，合肥 230036；2.中國農業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

小菜蛾［Plutella xylostella （Linnaeus）］，屬鱗翅目，菜蛾科，是一種世界性的十字花科蔬菜害蟲［1］。它是首個在田間對Bt制劑產生抗性的害蟲［2］。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種在自然界廣泛分布的革蘭氏陽性細菌，其主要特征是在芽胞形成的同時產生殺蟲晶體蛋白，對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等多種昆蟲具有特異殺蟲活性［3－6］。由于Bt對人畜無害，環(huán)境友好，在小菜蛾等重要農業(yè)害蟲防治中扮演了重要的角色，它是目前世界上開發(fā)時間最長、應用最成功的微生物殺蟲劑。截止到2012年4月，Bt國際命名委員會網站上已公布的Cry類殺蟲晶體蛋白有624種，其中Cry1類蛋白244種，Cry9類蛋白30種。

單價cry基因在應用過程中遇到了一些問題，例如毒力有限、殺蟲譜窄、害蟲易產生抗性等問題。1985年，Wu和Chang第一個證實了Bt以色列亞種（B.thuringiensis subsp.israelensis，Bti）中26ku和65ku蛋白組合有增效作用，26ku和130ku蛋白組合也表現(xiàn)出了相似的作用［7］。隨后其他Cry蛋白間的協(xié)同作用陸續(xù)報道。張杰等發(fā)現(xiàn)Cry1Ba和Cry3Aa基因組合對鞘翅目葉甲科害蟲具有高毒力［8］；薛 建 麗 對 甜 菜 夜 蛾 ［Spodoptera exigua（Hübner）］增效研究發(fā)現(xiàn)Cry1C和Cry1Aa等比混配時增效因子達到4.0［9］；Sharma發(fā)現(xiàn) Cry1Ab和Cry1Ac組合對斑禾草螟［Chilo partellus（Swinhoe）］有 3 倍 左 右 的 增 效 作 用［10］；Peng 等 發(fā) 現(xiàn)Cry6Aa和Cry55Aa等比混配對南方根結線蟲［Meloidogyne incognita （Kofoid et White）］增效可達5倍［11］。但是目前關于Cry蛋白對小菜蛾的增效研究很少，只有劉楠發(fā)現(xiàn)Cry1Ba與Cry1Ia組合對小菜蛾有相加作用的報道［12］。因此，尋找與篩選對小菜蛾高效的蛋白組合對于此類害蟲防治具有重要的意義。

中國農業(yè)科學院植物保護研究所先后克隆了cry1Ai2＊、cry1Ea8＊、cry9Aa3 基因［13］。研究發(fā)現(xiàn)Cry1Ai和Cry1Ea蛋白均對小菜蛾等鱗翅目害蟲具有高毒力（專利申請?zhí)枺?00910241558），Cry9Aa蛋白不僅對敏感種群小菜蛾和亞洲玉米螟［Ostrinia furnacalis（Guenée）］具有很強的毒殺作用，而且對Cry1Ac蛋白抗性小菜蛾也無交互抗性［13］。

本研究以Cry1Ai、Cry1Ea和Cry9Aa蛋白為材料，在單獨測定各種蛋白殺蟲活性的基礎上，把Cry1Ai＋ Cry1Ea、Cry1Ea＋ Cry9Aa、Cry1Ai＋Cry9Aa蛋白進行不同比例的混配，篩選到了對小菜蛾具有顯著增效作用的蛋白組合。這些結果將為工程菌的構建和轉基因抗蟲作物的培育提供優(yōu)良的殺蟲基因組合。

1 材料與方法

1.1 菌株特征及來源

所用菌株均為本組保藏，Rosetta－1Ai、Rosetta－1Ea和Rosetta－9Aa［13］分別為本實驗室構建的含有cry1Ai、cry1Ea、cry9Aa基因大腸桿菌表達菌株，詳見表1。

表1 菌株及其表達的Cry蛋白特性Table 1 Strains and properties of their expressed Cry proteins

1.2 試劑和設備

1.2.1 試劑

液體 LB培養(yǎng)基：1.0%胰蛋白胨（tryptone），0.5%酵母提取物（yeast extract），1.0%氯化鈉，pH 7.0，121 ℃／20min滅菌；抗生素：氨芐青霉素100mg／mL，氯霉素 34mg／mL，－20 ℃ 保存；IPTG：IPTG 水溶液1mol／L，－20 ℃保存；Tris－HCl：1mol／L（pH 8.0）121℃／20min滅菌后室溫保存；SI：50%乙醇，10%乙酸，40%去離子水；SII：7.5%乙酸，5%乙醇，87.5%去離子水；SIII：0.25%的考馬斯亮藍R250乙醇溶液；其他試劑均為國產或進口分析純化學試劑。

1.2.2 儀器設備

搖床：D250，美國NBS公司；落地式高速冷凍離心機：Avanti J－26XP，美國Beckman Coulter公司；蛋白電泳儀：Mini protein III美國Bio－Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)：Universal HoodⅡ，美國Bio－Rad公司；超聲波破碎儀：CP 750，寧波新芝生物公司。

1.3 供試昆蟲

敏感種群小菜蛾，2000年采自北京海淀區(qū)永豐甘藍菜地，由本實驗室采用蘿卜苗飼養(yǎng)。室內條件下，從卵孵化為幼蟲至化蛹需要14d左右，蛹3～4d后羽化成蟲，1～2d后成蟲交配、產卵；該試蟲一個生活史大約20d左右。

1.4 Cry蛋白的制備與分析

1.4.1 大腸桿菌培養(yǎng)與Cry蛋白提取

37 ℃ 過 夜 活 化 Rosetta－1Ai、Rosetta－1Ea、Rosetta－9Aa菌株，以1%的接種量轉接于液體LB培養(yǎng)基中，37℃，220r／min培養(yǎng)2h使其A600為0.5。加入誘導物IPTG，終濃度為0.5mmol／L。150r／min，20℃誘導10h，4 ℃，8 000r／min離心10min收集菌體。收集菌體加入20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）懸浮，超聲破碎完全后，4℃，12 000r／min離心10min，收集可溶組分，非可溶組分懸浮于20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）緩沖液中。

1.4.2 Cry蛋白SDS－PAGE分析

吸取蛋白溶液10μL，加入30μL ddH2O，加入10μL 5×Loading Buffer，充分混勻。100℃煮沸8min，12 000r／min離心5min，取上清為電泳樣品。SDS－PAGE電泳條件：4%濃縮膠，8%分離膠，80V電泳10min，140V電泳直到溴酚藍達到膠底邊緣并溢出電泳槽。電泳結束后取出凝膠，加入50mL SI加熱30s，60r／min振蕩10min；倒掉SI加入含SIII的SII（每50mL SII加200μL SIII）加熱30s，60r／min振蕩1h。上樣緩沖液、染色脫色液與凝膠配制參照文獻［14］。

1.5 生物活性測定

人工飼料購于美國Southland Products Incorporated公司，配制方法見產品說明。稱取15g人工飼料放置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入待測樣品的稀釋液1.5mL（10μg／g向下設定7個梯度，2倍梯度稀釋），充分攪拌混勻，平均分裝于3個平皿中，每皿接入20頭2齡幼蟲，醫(yī)用膠帶封口，每個濃度重復3次。兩種混配的Cry蛋白按照質量比混配成不同的蛋白溶 液 進 行 生 物測定，20mmol／L 的 Tris－Cl（pH－8.0）緩沖液作為空白對照，48h調查結果（L∥D＝16h∥8h，RH：50%）。

1.6 數(shù)據分析

采用National Institutes of Health開發(fā)的imageJ（V1.43）分析SDS－PAGE圖譜并進行定量，使用方法參考ImageJ User Guide1.43m。采用SPSS（V13.0）軟件計算LC50等相關結果，協(xié)同毒力指數(shù)采用Tabashnik公式法計算［15］，公式如下：

協(xié)同毒力指數(shù)＝預期LC50／實測LC50。由于試驗誤差和供試生物等未被覺察到的不一致性，一般認為：預期LC50與實測LC50的毒力比在0.5～2.6之間屬相加作用，大于2.6屬增效作用，小于0.5時屬拮抗作用（Finney法）［16］。

2 結果與分析

2.1 殺蟲蛋白SDS－PAGE分析

Cry1Ai、Cry1Ea、Cry9Aa蛋白 SDS－PAGE 分析結果見圖1。3種基因均能正常表達，Cry1Ai、Cry1Ea、Cry9Aa蛋白的分子量分別為133、133、129ku。利用imageJ定量，濃度分別為2.5、1.0、2.0mg／mL（可溶組分中Cry蛋白含量很低，圖略）。

圖1 3種Cry蛋白的SDS－PAGE定量分析Fig.1 SDS－PAGE quantitative analysis of 3Cry proteins

2.2 小菜蛾生物活性測定

2.2.1 Cry1Ai、Cry1Ea、Cry9Aa蛋白殺蟲結果

Cry1Ai、Cry1Ea、Cry9Aa蛋白對小菜蛾2齡幼蟲48h的LC50分別為1.52、5.47μg／g和3.27μg／g，結果詳見表2。3種蛋白對靶標害蟲均表現(xiàn)出了很高的毒力。

表2 3種Cry蛋白單獨及其混配（1∶1）對小菜蛾生物活性測定結果Table 2 Bioassay of 3Cry proteins，alone or mixture（1∶1），against P.xylostella

2.2.2 Cry1Ai＋Cry9Aa和Cry1Ea＋Cry9Aa蛋白混配組合殺蟲結果

在上述單一蛋白活性測定的基礎上，繼續(xù)測定了這3種蛋白兩兩等比例混合樣品的殺蟲活性，結果表明Cry1Ai＋Cry9Aa組合LC50＝0.23μg／g，增效因子為9.06，這個組合有非常顯著的協(xié)同增效作用。Cry1Ea＋Cry9Aa組合LC50＝0.60μg／g，增效因子為6.67，這個組合有明顯的增效作用。Cry1Ai＋Cry1Ea組合 LC50＝1.65μg／g，增 效 因 子 只 有1.43，說明這個組合僅有較強的相加作用（結果詳見表2）。

根據這些研究結果，我們針對Cry1Ai＋Cry9Aa和Cry1Ea＋Cry9Aa兩種組合分別設計了不同比例的毒素混配對小菜蛾的殺蟲測定。

表3結果顯示：Cry1Ai＋Cry9Aa蛋白組合1∶1混配時增效因子為9.06；1∶2混配時的增效因子為8.21；1∶4混配時的增效因子為8.71，說明1∶1混配時增效因子最高。

表3 不同比例的Cry1Ai＋Cry9Aa蛋白組合混配對小菜蛾的生物測定結果Table 3 Bioassay of the Cry1Ai＋Cry9Aa protein mixture with different proportions against P.xylostella

表4結果顯示：Cry1Ea＋Cry9Aa蛋白組合1∶1混配時增效因子為6.67；1∶2混配時的增效因子為5.92；1∶4混配時的增效因子為5.76，說明1∶1混配時增效因子最高。

表4 不同比例的Cry1Ea和Cry9Aa蛋白混配對小菜蛾的生物測定結果Table 4 Bioassay of the Cry1Ea＋Cry9Aa protein mixture with different proportions against P.xylostella

3 討論

本文在對Cry1Ai、Cry1Ea、Cry9Aa 3種蛋白對小菜蛾2齡幼蟲殺蟲活性測定的基礎上，篩選到對小菜蛾毒殺具有顯著增效的蛋白組合Cry1Ai＋Cry9Aa和Cry1Ea＋Cry9Aa。增效因子分別達到了9.06和6.67。并且研究了兩種蛋白以不同比例進行混配的殺蟲效果，得出的結論是蛋白進行等比混合時增效最顯著。

目前國內關于Bt對小菜蛾增效的研究很少，2010年劉楠利用Cry1Ba3和Cry1Ia8對小菜蛾增效，結果顯示兩者只有微弱的相加作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)了對小菜蛾具有顯著增效的蛋白組合，這種組合明顯提高了蛋白的毒力。而蘇慧琴等報道Cry9A等與Cry1A蛋白無交互抗性［13］，因此本研究獲得的Cry1Ai＋Cry9Aa和Cry1Ea＋Cry9Aa兩種高效組合有望在治理對Cry1A類蛋白產生抗性的害蟲中發(fā)揮重要的作用［17］。這些結果將為轉基因抗蟲植物的研發(fā)提供新的基因來源，同時將指導我們繼續(xù)深入發(fā)掘寶貴的Bt基因資源，實現(xiàn)Bt生防資源的可持續(xù)開發(fā)與利用。

Domain II決定毒素的專一性和與受體的特異性結合［18］，通過序列比對發(fā)現(xiàn)：Cry1Ai和 Cry9Aa的Domain II相似性為20.4%，Cry1Ea和Cry9Aa的Domain II相似性為22.6%，相似性都較低（比對數(shù)據來自http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）。推測這兩組蛋白在小菜蛾的BBMV上可能結合不同的受體進而產生協(xié)同增效作用。關于兩者協(xié)同增效的作用機制，還有待進一步的試驗結果來驗證。

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