黃亞麗， 王淑霞， 杜曉哲， 張麗萍＊

（1.河北省科學(xué)院生物研究所，主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，石家莊 050081；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050016）

化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用帶來(lái)的種種弊端，如有害生物抗藥性的產(chǎn)生、殘留毒性及環(huán)境污染等已成為危及生態(tài)平衡、人類(lèi)健康和社會(huì)發(fā)展的重要因素。隨著人類(lèi)對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)的關(guān)注及對(duì)環(huán)境問(wèn)題認(rèn)識(shí)的深化，開(kāi)發(fā)高效低毒生防制劑的呼聲日益高漲。利用微生物誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性進(jìn)行植物病害的生物防治是生防制劑開(kāi)發(fā)的新切入點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)利用微生物誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性具有抗病譜廣、持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)、可控的抗病性表達(dá)時(shí)間和空間且大部分誘導(dǎo)物對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特點(diǎn)［1－3］，這些特點(diǎn)決定了微生物誘導(dǎo)植物抗病性具有良好的應(yīng)用前景。

木霉是一種能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性的生物因子［4］，Bigirimana等人首次證明了木霉具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的能力［5－6］，隨后的研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉、棘胞木霉、深綠木霉、哈茨木霉等均可誘導(dǎo)植物獲得對(duì)廣譜性致病真菌、細(xì)菌、病毒等微生物的局部或系統(tǒng)抗性［4］，對(duì)具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的木霉菌株進(jìn)行篩選及研究可為新型生防制劑的開(kāi)發(fā)提供重要的材料。

Tr－92是由本課題組自植物根部土壤中分離出的一株拮抗木霉，對(duì)灰霉病菌、立枯絲核菌、鐮刀菌等十余種病原菌均具有拮抗作用。本研究通過(guò)對(duì)該菌與灰霉病菌在黃瓜的不同部位施用，發(fā)現(xiàn)該菌具有誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生對(duì)灰霉病菌系統(tǒng)抗性的能力，能夠增加誘導(dǎo)抗性相關(guān)酶活的表達(dá)量。該研究的進(jìn)行為優(yōu)化生防木霉的利用方式和提高其施用效果提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

木霉菌株為本實(shí)驗(yàn)室自植物根部土壤中分離保存；灰霉病菌為本實(shí)驗(yàn)室從溫室黃瓜病株上分離保存。

1.1.2 植物材料

黃瓜‘冀雜1號(hào)’。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDB液體培養(yǎng)基：200g去皮土豆切塊煮沸30min，4層紗布過(guò)濾后用蒸餾水補(bǔ)足1 000mL，加入葡萄糖20g。PDA固體培養(yǎng)基：為PDB液體培養(yǎng)基加入瓊脂15g。

1.2 誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的木霉菌株的篩選

1.2.1 木霉和灰霉病菌的培養(yǎng)及菌懸液的制備

將試管保存的木霉菌種接種到PDA平板，30℃恒溫培養(yǎng)5d，用無(wú)菌水沖洗木霉平板得到木霉孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整其濃度為106cfu／mL；將保存的灰霉病菌接種到PDA平板，24℃恒溫培養(yǎng)7～10d使用。

1.2.2 黃瓜的種植及誘導(dǎo)處理

挑選籽粒飽滿的黃瓜種子用無(wú)菌水沖洗3次，經(jīng)55℃恒溫水浴浸泡15min后用濕潤(rùn)紗布包好放在培養(yǎng)皿中30℃催芽，待大部分種子出芽后挑取出芽情況一致的種子播種于裝有滅菌蛭石的直徑10cm的塑料花盆中，每盆2粒種子，于20～24℃培養(yǎng)室（光照黑暗周期為16h：8h）進(jìn)行培養(yǎng)，黃瓜幼苗長(zhǎng)出5片真葉后，進(jìn)行誘導(dǎo)處理。

試驗(yàn)共3個(gè)處理：分別為清水對(duì)照（CK）、挑戰(zhàn)接種處理（只接種灰霉病原菌，H）、誘導(dǎo)處理（接種木霉和灰霉病菌，Tr－92＋H），每個(gè)處理30次重復(fù)。具體的處理方法為：用無(wú)菌注射器將5mL木霉孢子懸浮液注入誘導(dǎo)處理的黃瓜植株根部土壤中，向另外兩個(gè)處理中加入等量無(wú)菌水。木霉誘導(dǎo)接種24h后，打取直徑5mm的灰霉病菌菌塊倒扣接種到挑戰(zhàn)處理和誘導(dǎo)處理的黃瓜苗葉片上，每個(gè)真葉上接種1個(gè)菌塊，每株接種3片真葉，接種后保濕培養(yǎng)24h（濕度≥90%）。

待挑戰(zhàn)接種處理組葉面普遍發(fā)病后記錄并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，計(jì)算防病效果。計(jì)算公式如下：

病情指數(shù)＝∑（各級(jí)病葉數(shù)×病級(jí)數(shù)）／

（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高病級(jí)數(shù)）×100；

防病效果（%）＝（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）／

對(duì)照病情指數(shù)×100。

1.3 誘導(dǎo)抗性木霉菌株的鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)特征觀察

根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》、《木霉分類(lèi)與鑒定》等方法［7－9］，采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌，肉眼觀察菌落生長(zhǎng)特征、測(cè)量菌落生長(zhǎng)速度，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形狀及是否有橫隔、孢子大小、形狀、類(lèi)型等，掃描電鏡觀察分生孢子，對(duì)照確定菌株的種屬地位。

1.3.2 18SrDNA鑒定

將篩選菌株的孢子液接入PDB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)48h，過(guò)濾獲得菌絲，提取真菌基因組DNA［10－11］。以提取的真菌 DNA 作為模板，以NS1（5′－GTAGTCATATGCTTGTCTC－3′）和 NS8（5′－TCCGCAGGTTCACCTACGGA－3′）引 物 對(duì) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)體系為：基因組DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，NS1引物1μL，NS8引物1μL，dNTPs 2μL，Taq 酶0.25μL，ddH2O 17.25μL。反應(yīng)條件為：94 ℃5min，94℃ 30s，57 ℃ 50s，72 ℃ 50s；循環(huán)30次；72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序后，將獲得的DNA序列，輸入Gen－Bank，用Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較分析。利用MEGA4.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.4 Tr－92菌株誘導(dǎo)處理黃瓜幼苗根部對(duì)黃瓜葉片中系統(tǒng)抗性相關(guān)酶活的影響

試驗(yàn)處理如1.2，誘導(dǎo)接種木霉后第0h、24h、48h、72h、96h和120h采集倒第3片黃瓜葉片剪碎，進(jìn) 行 過(guò) 氧 化 物 酶 （POD）［12］、多 酚 氧 化 酶（PPO）［13］、苯丙氨酸解氨酶（PAL）［14］、β－1，3葡聚糖酶［15］、幾丁質(zhì)酶（CHI）［16］的測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)抗性木霉菌株的篩選

將12株具有拮抗能力的木霉菌株誘導(dǎo)接種到黃瓜幼苗根部，待對(duì)照發(fā)病后統(tǒng)計(jì)不同處理的病情指數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，與只接種灰霉病菌的挑戰(zhàn)處理相比，接種菌株Tr－92的誘導(dǎo)處理病情指數(shù)極顯著低于挑戰(zhàn)處理，防病效果達(dá)56.0%。由于木霉與病原菌接種于不同的部位，說(shuō)明該菌株具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生抗灰霉病的能力。

表1 木霉誘導(dǎo)對(duì)黃瓜幼苗病情指數(shù)的影響1）Table 1 Effects of Trichodermainduction on the disease index of cucumber seedlings

2.2 Tr－92菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)菌株Tr－92進(jìn)行平板培養(yǎng)及載片培養(yǎng)，平板培養(yǎng)觀察其菌落形態(tài)，載片培養(yǎng)在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行菌絲和孢子形態(tài)的觀察，并將木霉孢子進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1a、b、c、d。

圖1 木霉Tr－92的形態(tài)Fig.1 Morphology of Trichoderma Tr－92

將5mm Tr－92菌株的菌絲塊接種到PDA上，28℃恒溫培養(yǎng)24h后肉眼可看到清晰的菌絲體，菌落擴(kuò)展較快，培養(yǎng)72h菌落直徑為80mm，菌絲層較厚，致密絨狀，菌落初期為白色，后期因產(chǎn)生孢子而呈綠色。菌落背面初為無(wú)色，后期成黃褐色（圖1）。

在顯微鏡下觀察，菌絲透明，有隔，內(nèi)含物豐富，細(xì)胞壁光滑，菌絲生長(zhǎng)端呈橢圓形。分生孢子梗由菌絲直立生出，無(wú)色，對(duì)生二至三級(jí)分枝，分枝與分生孢子梗近似直角，小梗瓶形，瓶體端部尖削，微彎，尖端生分生孢子。分生孢子橢圓形，一端略尖，孢子長(zhǎng)直徑4.5～5.5μm，短直徑3～4μm，表面光滑。根據(jù)《中國(guó)真菌志》等，菌株Tr－92依形態(tài)學(xué)特征初步鑒定為木霉屬（Trichoderma）。

2.3 Tr－92菌株的分子生物學(xué)鑒定

以Tr－92菌株的總DNA為模板利用NS1、NS8引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，得到一條明亮特異條帶，長(zhǎng)約1 800bp，與18S rDNA序列大小一致。上述結(jié)果表明：成功擴(kuò)增了Tr－92菌株的18SrDNA核酸片段。獲得的Tr－92菌株18SrDNA核酸序列（GenBank登錄號(hào)為：BankIt1533635 Trichoderma JX029044）。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)：Tr－92菌株與哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的18SrDNA核酸序列相似性最高，為99%；根據(jù)18S rDNA序列對(duì)Tr－92及相近物種進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明Tr－92 18SrDNA序列與哈茨木霉的序列同源性最近。因此，鑒定Tr－92菌株為哈茨木霉。

根據(jù)Tr－92的18SrDNA序列分析，結(jié)合其分生孢子梗、分生孢子及菌絲形態(tài)特征，將其鑒定為 哈茨木霉。

圖2 菌株Tr－92的基于18SrDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree constructed using 18SrDNA sequences

2.4 誘導(dǎo)接種Tr－92菌株對(duì)黃瓜葉片中誘導(dǎo)抗性相關(guān)酶活性的影響

大量研究表明，植物誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生是通過(guò)防御酶系活動(dòng)而實(shí)現(xiàn)的，所以本研究測(cè)定了利用Tr－92菌株誘導(dǎo)處理后黃瓜幼苗葉片中過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、β－1，3葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶的活性（圖3）。由圖4可以看出，木霉Tr－92菌株接種能夠誘導(dǎo)黃瓜葉片中過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、β－1，3葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生，誘導(dǎo)處理24h后測(cè)定各處理防御酶活性發(fā)現(xiàn)，接種木霉Tr－92菌株的誘導(dǎo)處理各酶活性均高于對(duì)照，這種活性增高一直持續(xù)整個(gè)測(cè)定時(shí)期（誘導(dǎo)處理120h后），誘導(dǎo)處理過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶、β－1，3葡聚糖酶活性的峰值分別是對(duì)照處理的3.61、1.44、3.94、1.34、1.39倍。試驗(yàn)結(jié)果表明，防御酶系活動(dòng)增強(qiáng)是木霉誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生抗灰霉病系統(tǒng)抗性的機(jī)制之一。

圖3 菌株Tr－92對(duì)黃瓜葉片中防御酶活性的影響Fig.3 Effects of the strain Tr－92on the activity of resistance enzymes in cucumber leaves

3 討論

植物誘導(dǎo)抗病性是調(diào)動(dòng)植物內(nèi)在抗性機(jī)制的一種新的病害防治對(duì)策，是植物受到激發(fā)子誘導(dǎo)后，調(diào)動(dòng)體內(nèi)防御系統(tǒng)抵御病原物的侵染，使植物免受或減輕病原菌危害的一種現(xiàn)象。具有新型、廣譜、高效、多功能、無(wú)殘留等優(yōu)勢(shì)，在植物病害防治中具有突出的優(yōu)勢(shì)。

木霉是一種可以激發(fā)植物誘導(dǎo)抗病性的生防因子，誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生一系列局部或系統(tǒng)防御反應(yīng)［4］。張婷 研 究 發(fā) 現(xiàn)，木 霉 菌 株 H6、D9、C40、SH2303包衣種子可以誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生抗彎孢葉斑病的效果，在溫室條件對(duì)彎孢葉斑病的防效分別為20.69%、53.77%、72.74%、37.52%［17］。本研究通過(guò)生測(cè)試驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)室保存的拮抗木霉菌株中篩選到一株具有誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生灰霉病抗性的菌株Tr－92，與挑戰(zhàn)接種處理相比其誘導(dǎo)防病效果為56.0%。說(shuō)明該拮抗木霉菌株除了具有直接拮抗病原菌的效果外，還能夠通過(guò)激發(fā)黃瓜自身的防御系統(tǒng)達(dá)到防病的效果。對(duì)該菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，該菌株為哈茨木霉，該種是一種常見(jiàn)木霉拮抗種，已經(jīng)在生防方面有一些報(bào)道。該研究的進(jìn)行可以為木霉在生物防治上的應(yīng)用提供新的菌株，特別是對(duì)于葉面病害的防治來(lái)講，利用誘導(dǎo)抗性木霉在根部接種就可有效防治，從而降低了環(huán)境因素：如紫外線、降雨等對(duì)木霉在葉面定殖的不良影響。

植物誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生是通過(guò)防御酶系活動(dòng)而實(shí)現(xiàn)的，研究表明植物系統(tǒng)抗性反應(yīng)與植物自身的苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、脂氫過(guò)氧化物裂解酶、過(guò)氧化物酶、幾丁質(zhì)酶、β－1，3－葡聚糖酶等活性增加關(guān)系密切［18－19］。徐韶等研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生枯草芽胞桿菌B6和木霉T23復(fù)合接種能夠誘導(dǎo)甜瓜根系苯丙氨酸解氨酶、過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶和β－1，3－葡聚糖酶活性不同程度的提高［20］。本試驗(yàn)利用木霉Tr－92孢子懸浮液在黃瓜幼苗根部灌施，分析比較了黃瓜葉片防御反應(yīng)酶系苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶、幾丁質(zhì)酶和β－1，3－葡聚糖酶活性的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明：木霉Tr－92能夠誘導(dǎo)黃瓜葉片中PAL、PPO、POD等酶活性不同程度的提高，從接種之后到120h，誘導(dǎo)處理中黃瓜葉片防御酶活性都顯著高于挑戰(zhàn)接種處理和清水對(duì)照，說(shuō)明接種木霉Tr－92有利于防御反應(yīng)酶基因的表達(dá)，這與徐韶等研究結(jié)果相類(lèi)似。

由于本研究采用的是木霉與灰霉病菌不同位點(diǎn)接種，通過(guò)木霉黃瓜幼苗根部接種后，可以增加黃瓜葉部抗性相關(guān)酶活性的表達(dá)量、降低葉部病害的病情指數(shù)；另外試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)葉部進(jìn)行了真菌分離，發(fā)現(xiàn)葉部沒(méi)有木霉定殖，說(shuō)明黃瓜中系統(tǒng)抗性相關(guān)酶活及葉部病害病情指數(shù)的變化是由于木霉誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)果，表明誘導(dǎo)抗性是木霉Tr－92生防機(jī)制中的一個(gè)重要方面，可在植物病害綜合防治中發(fā)揮重要作用，為植物病害生物防治提供了一種新思路。

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