王加男，趙虹薪，劉洋，姜鴻濤，秦秀麗

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院生物與制藥工程學院，吉林 132101）

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，蟲害是導致果蔬及農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因之一。目前，防治蟲害主要以噴灑化學農(nóng)藥為主，不僅造成環(huán)境污染，還使害蟲產(chǎn)生抗藥性，殺蟲效果降低。噴施化學農(nóng)藥導致果蔬及農(nóng)作物農(nóng)藥殘留，用這些原料加工食品，對人體健康造成危害。因此，使用生物農(nóng)藥已成為綠色農(nóng)業(yè)防治蟲害的重要措施。真菌性殺蟲劑是生物農(nóng)藥的重要組成部分，球孢白僵菌是研究應用最多的昆蟲真菌性殺蟲劑，具有致病性強、應用范圍廣、對環(huán)境無明顯污染等優(yōu)點[1-3]。球孢白僵菌對環(huán)境安全，在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應用前景[4-5]。球孢白僵菌產(chǎn)孢數(shù)量與殺蟲效果呈正相關[6]。目前關于球孢白僵菌菌劑的產(chǎn)孢條件報道較少。本研究對球孢白僵菌菌劑產(chǎn)孢條件進行探討，篩選球孢白僵菌菌劑產(chǎn)孢適宜的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，旨在為球孢白僵菌菌劑的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料方

1.1 試驗材料

1.1.1 趨避試驗供試菌株球孢白僵菌JN06由吉林農(nóng)業(yè)科技學院農(nóng)學院植物保護實驗室提供。

1.1.2 菌種活化培養(yǎng)基薩氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L，瓊脂20 g/L，pH 5.5～6.5，將其配制成斜面試管培養(yǎng)基備用。

1.2 孢子液制備

將球孢白僵菌JN06接種于薩氏斜面試管培養(yǎng)基，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至分生孢子成熟。然后用無菌水將孢子沖洗至300 mL三角瓶中，用磁力攪拌器均勻打散，將孢子懸浮液孢子濃度調至107個/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹6-7]。

1.3 產(chǎn)孢培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗

1.3.1 碳源優(yōu)化試驗(1)主要原料優(yōu)化。分別為A：玉米糠97%；B：玉米糠87%+麥麩10%；C：玉米糠87%+玉米粉10%；D：玉米糠87%+10%大麥米；E：玉米糠87%+10%高梁米為主要原料，大麥米及高梁米用水浸泡24 h后撈出，將主料拌勻，分別加入1%蔗糖、蛋白胨、CaSO4配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含水量調至60%。(2)速效有機碳源優(yōu)化。在篩選出的主要原料中，分別加入1%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蛋白胨、CaSO4配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含水量調至60%。

1.3.2 氮源優(yōu)化試驗在篩選出的主要原料中，分別加入1%蛋白胨、酵母粉、魚粉、尿素、NH4NO3以及優(yōu)化的1%速效有機碳源、1%CaSO4配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含水量調至60%。

1.3.3 無機鹽優(yōu)化試驗在篩選出的主要原料中，加入優(yōu)化的速效有機碳源和氮源各1%，再分別添加1%的CaSO4、KH2P O4、MgSO4，以及CaSO40 .5%+KH2P O40 .5%、CaSO40 .5%+MgSO40 .5%、KH2P O40 .5%+MgSO40.5%配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含水量調至60%。

1.3.4 培養(yǎng)基適宜配方優(yōu)化試驗根據(jù)上述單因素試驗結果，設計4水平5因素L16（45）正交試驗，如表1所示，配制16種培養(yǎng)基，確定最適培養(yǎng)基配方。

1.3.5 培養(yǎng)方法將培養(yǎng)基拌勻后裝入24 cm×12 cm聚丙烯塑料袋中，松緊適度，裝至塑料袋2/3處，用無棉蓋體將袋封口，每個水平裝5袋。將裝好的培養(yǎng)基塑料袋經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，在無菌條件下接入10 mL的球孢白僵菌孢子液，在溫度為25℃、空氣相對濕度為60%～70%的無光條件下培養(yǎng)至孢子成熟。

1.4 產(chǎn)孢條件優(yōu)化

1.4.1 不同培養(yǎng)溫度對產(chǎn)孢量的影響選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，按上述方法裝袋、滅菌、接種后，把菌袋分別放入溫度為18、20、22、25、27、29℃的條件下下，空氣相對濕度為60%～70%，無光條件下培養(yǎng)至孢子成熟。考查孢子形成的最適培養(yǎng)溫度。每個水平裝5袋。

1.4.2 不同空氣相對濕度對產(chǎn)孢量的影響選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，按上述方法裝袋、滅菌、接種后，把菌袋分別放入空氣相對濕度為65%、75%、80%、85%、90%、95%的條件下，在適宜溫度及無光條件下培養(yǎng)至孢子成熟。每個水平裝5袋。

1.5 產(chǎn)孢及孢萌發(fā)測

從每個菌袋的袋口處稱取50 g含有孢子的培養(yǎng)基，放入105℃的電熱恒溫干燥箱中烘干1 h，粉碎后制成粉劑。取1 g球孢白僵菌干粉參照國家標準GB/T25864-2010[8]測定產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量，每個樣品重復3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel、SPSS軟件統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)[9-10]。

2 結果與析

2.1 產(chǎn)孢養(yǎng)基方優(yōu)

2.1.1 不同主要原料對產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響以5種主要原料配制培養(yǎng)基進行產(chǎn)孢培養(yǎng)，測定其產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量。由圖1可知，在其他營養(yǎng)成份和培養(yǎng)條件不變的情況下，主要原料不同的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量不同，5種主要原料配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量依次為B>C>D>E>A，選擇B為主要原料配制的培養(yǎng)基球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高，產(chǎn)孢量達1.483×1011個/g，孢子萌發(fā)量達1.429×1011個/g；其次為主要原料C配制的培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量為1.464×1011個/g，孢子萌發(fā)量為1.389×1011個/g?？芍?，以B為主要原料配制的培養(yǎng)基是球孢白僵菌產(chǎn)孢最適的培養(yǎng)基，主要原料為2種以上配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量均高于單一主要原料A配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量。

圖1 不同主要原料產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

2.1.2 不同速效有機碳源對產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響選用B為主要原料配制的培養(yǎng)基，按1.3.1方法進行速效有機碳源優(yōu)化試驗，測定產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量。由圖2可知，4種速效有機碳源配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量依次為葡萄糖>蔗糖>果糖>麥芽糖>乳糖，以葡萄糖為速效有機碳源配制的培養(yǎng)基球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高，產(chǎn)孢量達1.632×1011個/g，孢子萌發(fā)量達1.589×1011個/g；其次為以蔗糖為速效有機碳源配制的培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量為1.483×1011個/g，分生孢子萌發(fā)量為1.429×1011個/g。以乳糖為速效有機碳源配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最低。

圖2 不同速效有機碳源產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

2.1.3 不同氮源對產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響選用B為主要原料，以葡萄糖為速效有機碳源配制的培養(yǎng)基，按1.3.2方法進行氮源優(yōu)化試驗，測定產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量。從圖3可以看出，5種氮源培養(yǎng)基產(chǎn)孢量依次為蛋白胨>酵母粉>魚粉>NH4NO3>尿素。以蛋白胨為氮源配制的營養(yǎng)基球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高，產(chǎn)孢量達1.632×1011個/g，孢子萌發(fā)量達1.589×1011個/g；其次為酵母粉為氮源配制的培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量為1.587×1011個/g，孢子萌發(fā)量為1.536×1011個/g。以尿素為氮源配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最低。

圖3 不同氮源產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

2.1.4 不同無機鹽對產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響選用B為主要原料，以葡萄糖和蛋白胨為速效有機碳源和氮源，按1.3.3方法進行無機鹽優(yōu)化試驗，測定產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量。由圖4可知，6種不同無機鹽配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量依次為CaSO4+KH2PO4>K2HPO4+MgSO4>K2HPO4>CaSO4>CaSO4+MgSO4>MgSO4。以CaSO4+KH2PO4為無鹽配制的培養(yǎng)基球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高，產(chǎn)孢量為1.663×1011個/g，孢子萌發(fā)量為1.601×1011個/g。以MgSO4為無機鹽配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最低。

圖4 不同無機鹽產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

2.2 培養(yǎng)基適宜配方優(yōu)化試驗

正交試驗設計如表1所示，培養(yǎng)配方正交試驗結果如表2所示。由表2可知，球孢白僵菌培養(yǎng)基最適配方為A3B3C2D2E4，即玉米糠83%+麥麩14%、葡萄糖1.5%、蛋白胨1.0%、K2HPO40.5%、CaSO41.5%。從極差R可知，培養(yǎng)基中各組分對產(chǎn)孢量影響的主次因素依次為A主料>B葡萄糖>ECaSO4>DK2HPO4>C蛋白胨。

表1 L16（45）培養(yǎng)基配方正交試驗因素及水平

表2 L16（45）培養(yǎng)基配方正交試驗結果

2.3 驗證試驗

為了驗證正交試驗最優(yōu)組合的產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量，以A3B3C2D2E4配制的培養(yǎng)基，含水量調至60%，裝10袋滅菌后接種培養(yǎng)，測定產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量。測得A3B3C2D2E4配方的產(chǎn)孢量為1.784×1011個/g，孢子萌發(fā)量為1.736×1011個/g，萌發(fā)率為97.3%。

2.4 產(chǎn)孢條件優(yōu)化

2.4.1 不同培養(yǎng)溫度對產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響由圖5可知，隨著溫度升高，球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量逐漸升高，溫度為26 ℃時產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)量最高，產(chǎn)孢量為1.781×1011個/g，孢子萌發(fā)量1.733×1011個/g；當溫度低于22 ℃時，產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量較低；當溫度超過26℃時，產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)量隨溫度升高呈下降的趨勢。

圖5 不同培養(yǎng)溫度產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

2.4.2 不同空氣相對濕度對產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響由圖6可知，隨著空氣相對濕度升高，球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量逐漸升高，當空氣相對濕度為85%～90%時，產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高；當空氣相對濕度超過90%時，產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量呈下降的趨勢。

圖6 不同空氣相對濕度產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

3 結論討

球孢白僵菌菌劑產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量是鑒定球孢白僵菌菌劑質量的重要指標。在菌劑生產(chǎn)過程中球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量受營養(yǎng)條件和環(huán)境條件的影響。關于球孢白僵菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究已有一些報道，例如陳孟等[11]以大米為培養(yǎng)基對其產(chǎn)孢條件進行優(yōu)化；王爽等[12]對球孢白僵菌菌株固化培養(yǎng)基及產(chǎn)孢條件進行研究；張亞平等[13]對球孢白僵菌液體培養(yǎng)營養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件進行研究可知，球孢白僵菌在不同的培養(yǎng)基質上產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量不同。而生產(chǎn)球孢白僵菌菌劑需采用固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，通過本研究優(yōu)化的球孢白僵菌菌劑適宜的配方為米糠83%+麥麩14%、葡萄糖1.5%、蛋白胨1%、K2HPO40.5%、CaSO41.5%，以此為培養(yǎng)基質球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量均達到球孢白僵菌劑的國家標準，并且所用原料來源廣、易得、成本低。

溫度和空氣相對濕度是影響球孢白僵菌菌劑產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量重要的環(huán)境因素，通過本研究確定生產(chǎn)球孢白僵菌的適宜溫度為26℃、空氣相對濕度為85%～90%時，產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)當空氣相對濕度超90%時，容易發(fā)生其他霉菌污染，對球孢白僵菌菌劑的質量有較大影響。本研究僅對生產(chǎn)白僵菌菌劑的培養(yǎng)基配方及溫度和空氣相對濕度重要的環(huán)境因素進行了研究與探討，而對生產(chǎn)所獲得的球孢白僵菌孢子粉劑的毒力影響因素并沒有涉及，對球孢白僵菌毒力的影響因素還需深入研究和探討。