莊緒靜， 尹 姣， 李克斌， 曹雅忠

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，北京 100193）

昆蟲在復(fù)雜多變的環(huán)境中能夠準(zhǔn)確而迅速地對配偶及寄主植物進行定位及選擇，主要是由于昆蟲與昆蟲之間，昆蟲與植物之間存在著復(fù)雜的信息交流，傳遞這些信息的氣味化合物就是昆蟲與昆蟲或者昆蟲與植物之間的化學(xué)語言，與此相適應(yīng)，昆蟲在長期進化過程中形成的對氣味物質(zhì)高度特化的感覺器官及感應(yīng)機制，能識別環(huán)境中特異的化學(xué)氣味分子。觸角就是昆蟲重要的嗅覺器官，對氣味分子具有識別和鑒定的作用。其中，氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，OBP）是氣味分子進入觸角后遇到的第一個蛋白，氣味物質(zhì)多為脂溶性小分子化合物，這些氣味物質(zhì)通過擴散的方式穿過觸角上皮細胞之間的孔道到達嗅覺感受器的淋巴液中，但這些脂溶性物質(zhì)不能直接通過淋巴液的液體環(huán)境，氣味結(jié)合蛋白在氣味物質(zhì)的傳遞過程中起著重要的作用［1－2］。

國內(nèi)外學(xué)者對昆蟲氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）已開展了大量的研究，目前認(rèn)為它是一類相對低分子質(zhì)量（15 000左右）、等電點偏酸性（pH 4.0～5.0）、球狀的水溶性蛋白，多肽鏈全長約120～160個氨基酸，由6～7個α螺旋組成，N末端有一段20個氨基酸左右的信號肽，序列中有6個保守的半胱氨酸形成3對二硫鍵［3］。其主要功能是運輸脂溶性的氣味物質(zhì)，通過嗅覺淋巴液到達神經(jīng)樹突膜上的受體，從而使昆蟲產(chǎn)生嗅覺反應(yīng)。

在OBPs功能研究中，氣味結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)及其與其配體分子之間的結(jié)合機制研究是目前研究的熱點。通過X衍射方法，首先解析了果蠅的普通氣味結(jié)合蛋白（LUSH）與乙醇的晶體結(jié)構(gòu)，明確Thr57是結(jié)合的關(guān)鍵位點［4－5］。Sandler等［6］對家蠶信息素結(jié)合蛋白（BmorPBP）與蠶蛾性誘醇的結(jié)構(gòu)進行X衍射后發(fā)現(xiàn)，蠶蛾性誘醇在蛋白的活性區(qū)域內(nèi)與蛋白通過氫鍵和疏水作用相互作用，其中與氨基酸殘基Ser56形成的氫鍵起著關(guān)鍵作用。2011年，毛楊等人對致倦庫蚊氣味結(jié)合蛋白CquiOBP1與MOP的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，其相互作用力是范德華力和疏水作用而非氫鍵［7］。

金龜子屬于鞘翅目金龜甲類昆蟲，全世界約有3.5萬種，我國已記錄的約有1 800種［8］，其幼蟲－蠐螬具有種類多、分布廣、食性雜、生活隱蔽、適應(yīng)性強、生活史長短不一等特點，是國內(nèi)外公認(rèn)的難以防治的土棲性害蟲。不同于幼蟲的地下為害，成蟲取食、交配及產(chǎn)卵等活動多在地面進行，因而從成蟲入手是針對金龜子類昆蟲簡便而有效的防治途徑，其中利用昆蟲的嗅覺控制害蟲數(shù)量是一項較為可行的措施，這類環(huán)境友好型防治措施對于防治金龜子具有廣闊的應(yīng)用前景。

本文對華北大黑鰓金龜氣味結(jié)合蛋白HoblOBP2進行同源建模，模擬蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并利用分子對接技術(shù)對HoblOBP2與其特異氣味分子苯甲酸己酯進行對接，以期解析HoblOBP2與氣味分子之間的結(jié)合機制，并明確HoblOBP2結(jié)合氣味分子的特異性位點。

1 材料與方法

1.1 材料

HoblOBP2的序列來自GenBank，登錄號為GQ856257。三級結(jié)構(gòu)可視化軟件SwissPdb－Viewer（SPDBV）。

1.2 蛋白質(zhì)序列的基本性質(zhì)分析

應(yīng)用EMBOSS6.3.1軟件包的pepstats程序分析HoblOBP2的氨基酸殘基數(shù)量、等電點和相對分子質(zhì)量，tmap程序查看蛋白質(zhì)是否有跨膜區(qū)，使用ExPASy平臺中的SignaIP 3.0Serve程序（http：∥www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）軟件預(yù)測蛋白質(zhì)氨基酸序列的信號肽位置。

1.3 HoblOBP2的同源建模與模型分析

通過Blast搜索選擇建立模型的合適模板，在同源建模服務(wù)器 SWISS－MODEL［9］（http：∥swissmodel.expasy.org／），對去掉信號肽的 HoblOBP2氨基酸序列進行建模，其結(jié)果用 DeepView［10］（Swiss Pdb－View mode）進行觀察。利用同源建模方法獲得該蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，然后用在線評價服務(wù)器PRO－CHECK對所建模型進行評價［11］。獲得的HoblOBP2三維結(jié)構(gòu)在SwissPdb－Viewer（SPDBV）中顯示，并分析其結(jié)構(gòu)特點。

1.4 HoblOBP2與苯甲酸己酯的對接及分析

由于配體小分子與受體蛋白質(zhì)的結(jié)合是一個“動態(tài)契合”的過程，配體和受體的構(gòu)象在結(jié)合前后會發(fā)生一定程度上的改變，而且目前大多數(shù)對接算法僅考慮配體的柔性而忽略受體的柔性，這往往會降低對接計算的準(zhǔn)確性。另外，我們對接所采用的HoblOBP2蛋白的三維結(jié)構(gòu)為同源模建結(jié)構(gòu)，其精度要低于晶體結(jié)構(gòu)，考慮受體活性位點的柔性將有利于得到更為合理的結(jié)果。因此，我們選用autodock／flexible residues模塊來開展柔性分子對接研究，該對接策略能同時考慮受體活性位點和配體的柔性。

華北大黑鰓金龜兩種氣味結(jié)合蛋白OBP1和OBP2的功能研究已經(jīng)深入開展。熒光競爭結(jié)合實驗表明這兩種蛋白對醇類、醛類、酯類、萜烯類、酮類化合物中的部分物質(zhì)都有著較好的結(jié)合活性，其中對苯甲酸酯類的結(jié)合能力相對比較突出［5］，因此本試驗選擇苯甲酸己酯作為分子對接的配體分子。

首先，利用chemoffice 2004模擬苯甲酸己酯的三級結(jié)構(gòu)，然后應(yīng)用Autodock4.0軟件將苯甲酸己酯與HoblOBP2蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行分子對接。對接后的結(jié)合產(chǎn)物在SwissPdbViewer中顯示，并且分析HoblOBP2結(jié)合氣味分子的分子機制及關(guān)鍵結(jié)合位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)序列的基本性質(zhì)分析

HoblOBP2相對分子質(zhì)量為17 435.00，共159個氨基酸殘基，各種氨基酸含量如表1所示；理論等電點為5.028 2，帶電荷氨基酸殘基（Asp＋Glu＋His＋Lys＋Arg）共44個，酸性氨基酸殘基（Asp＋Glu）為23個，包含1個跨膜區(qū)，即4～27位氨基酸殘基，序列為 HSITGFKMKYFVVFAALCAYVLGD，見圖1。還包含由26個氨基酸殘基組成的信號肽。

圖1 HoblOBP2跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果Fig.1 Prediction of transmembrane domain of HoblOBP2

表1 HoblOBP2氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of HoblOBP2

2.2 HoblOBP2的同源建模與模型分析

在Protein Data Bank中對HoblOBP2序列進行Blast搜索，結(jié)果顯示有6種已知結(jié)構(gòu)的昆蟲氣味蛋白與其序列相似，這6種氣味結(jié)合蛋白分別為：家蠶（Bombyx mori）PBP（BmorPBP）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）OBP17（AgamOBP17）、家蠶（Bombyx mori）GOBP2（BmorGOBP2）、臍 橙 螟（Amyelois transitella）PBP1（AtraPBP1）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）OBP1（AaegOBP1）、多音大蠶（Antheraea polyphemus）PBP（ApolPBP）和意大利蜜蜂（Apis mellifera）PBP （AmelPBP）。以 AtraPBP1為模板（相似度最高）同源建模后可以清晰地觀測到HoblOBP2的三維結(jié)構(gòu)（圖2），將構(gòu)建好的結(jié)構(gòu)模型同樣用Pro－CHECK檢測評估分析發(fā)現(xiàn)，如圖3所示，模建蛋白90.8%的殘基落在最佳區(qū)域（紅色區(qū)域A，B，L），7.3%的殘基落入其他許可區(qū)（亮黃色區(qū)域a，b，l，p），1.9%的殘基落在勉強許可區(qū)（淡黃色區(qū)域－a，－b，－l，－p），0.0%的殘基落在不允許區(qū)，落在最佳區(qū)域的殘基為90.8%，大于90%，說明構(gòu)建的HoblOBP2屬于高質(zhì)量的模型，是準(zhǔn)確可靠的。

圖2 HoblOBP2的三級結(jié)構(gòu)Fig.2 Tertiary structure of HoblOBP2

其具有昆蟲普通氣味結(jié)合蛋白的典型結(jié)構(gòu)特點，包括6個α螺旋，分別由9－25（α1），30－36（α2），44－55（α3），68－73（α4），86－95（α5）和106－120（α6）位氨基酸組成。6個保守的半胱氨酸殘基形成3對二硫鍵起著穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，二硫鍵CYS21－CYS52連接 α1 和 α3，CYS48－CYS107 連接 α3 和α6，CYS96－CYS116連接α5和α6。5個反向平行的α螺旋（α1、α3、α4、α5和α6）形成了 HoblOBP2蛋白內(nèi)部結(jié)合口袋，α2不參與口袋的形成，但是它在口袋的另一端像一個蓋子一樣蓋在口袋上方。較長的C－末端折合進入蛋白質(zhì)口袋內(nèi)部，使得口袋更加穩(wěn)固。

圖3 預(yù)測的HoblOBP2的三維結(jié)構(gòu)Fig.3 Predicted 3Dmodel of HoblOBP2

蛋白質(zhì)結(jié)合口袋內(nèi)的氨基酸殘基大部分是疏水性的，例如ILE58，LEU61，ILE66，PRO67，GLY72，LEU73，VAL75，VAL76，CYS132，GLY136，VAL137和VAL140。也有一部分親水性殘基如THR54， ASP57， GLN65， SER69， SER77和LYS141。

2.3 HoblOBP2與苯甲酸己酯的對接結(jié)果

為了更好地研究HoblOBP2結(jié)合氣味分子的特性，選擇與HoblOBP2結(jié)合能力較強的苯甲酸己酯（圖4）與已經(jīng)構(gòu)建的HoblOBP2三維模型進行對接，對接結(jié)果如圖5所示。我們發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)與配體分子之間并沒有形成氫鍵，主要是通過范德華力和疏水作用而相互作用的。在HoblOBP2蛋白結(jié)合活性區(qū)域，與苯甲酸己酯分子距離小于4?的殘基有THR54，ASP57，ILE58，LEU61，GLN65，ILE66，PRO67，SER69，GLY72，LEU73，VAL75，VAL76，GLY136，VAL137和VAL140，其中距離最近的是LEU73（2.10?），在該位點與苯甲酸己酯的范德華力最大（圖6），它可能與HoblOBP2結(jié)合氣味分子的特異性有關(guān)。雖然蛋白質(zhì)與苯甲酸己酯之間沒有氫鍵形成，但是我們發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)活性區(qū)域內(nèi)有蛋白分子內(nèi)氫鍵的形成，如圖7所示，在蛋白口袋的內(nèi)部，靠近苯甲酸己酯苯環(huán) 的 一 端，THR54：H－ASP57：O，THR54：OASP57：HN和 THR54：O－ILE58：HN 形成三對分子內(nèi)氫鍵鎖住苯甲酸己酯分子。在蛋白C末端，VAL137：HN－CYS133：O和 VAL137：O－LYS141：HN形成兩對分子內(nèi)氫鍵鎖住苯甲酸己酯。在AgamOBP1，AaegOBP1及CquiOBP1·MOP中都有類似的 C－末端結(jié)構(gòu)［7，12－13］。由此，推測均能形成雙氫鍵的THR54與VAL137位點可能是HoblOBP2結(jié)合氣味分子的關(guān)鍵位點。

通過以上預(yù)測分析，LEU73、THR54與VAL137可能是華北大黑鰓金龜氣味結(jié)合蛋白HoblOBP2結(jié)合氣味分子的活性位點。

3 討論

對大黑鰓金龜?shù)臍馕督Y(jié)合蛋白同源建模后發(fā)現(xiàn)，其三維預(yù)測結(jié)構(gòu)主要由6個α螺旋構(gòu)成，存在3對二硫鍵，分別是二硫鍵CYS21－CYS52連接α1和α3，CYS48－CYS107連接α3和α6，CYS96－CYS116連接α5和α6，這5個α螺旋形成疏水口袋，二硫鍵起著穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，只有α2不參與疏水結(jié)合口袋的形成，而是像一個蓋子一樣在口袋的另一端，這與東亞飛蝗LimgOBP1［14］的三維結(jié)構(gòu)中口袋的形成是相同的。與此稍有不同的是，在家蠶BmorPBP的三維結(jié)構(gòu)中，由4個反向平行的α螺旋（α1，α4，α5，α6）形成疏水口袋，α2和α3不參與口袋形成。因此，我們推測不同昆蟲氣味結(jié)合蛋白三維結(jié)構(gòu)疏水結(jié)合口袋的形成是有一定的差異的，可能與其功能密切相關(guān)。

華北大黑鰓金龜兩種氣味結(jié)合蛋白OBP1和OBP2的功能研究已經(jīng)深入開展。熒光競爭結(jié)合實驗表明這兩種蛋白對醇類、醛類、酯類、萜烯類、酮類化合物中的部分物質(zhì)都有著較好的結(jié)合活性，其中對苯甲酸酯類的結(jié)合能力相對比較突出［15］，因此本試驗選擇苯甲酸己酯作為分子對接的配體分子。

目前普遍認(rèn)為氣味結(jié)合蛋白結(jié)合與釋放氣味分子的過程與氣味分子自身的構(gòu)象、觸角感器淋巴液的pH和神經(jīng)元樹突膜附近的鹽離子濃度有關(guān)，并且不同昆蟲的氣味結(jié)合蛋白的結(jié)合、釋放配體的機制存在差異［16］。比較經(jīng)典的蛋白與配體分子的結(jié)合理論是家蠶信息素結(jié)合蛋白BmorPBP與信息素的結(jié)合／釋放過程。研究表明，家蠶信息素結(jié)合蛋白BmorPBP的構(gòu)象隨pH的改變而變化，當(dāng)pH為6.5并有其信息素蠶蛾醇存在時，BmorPBP是“緊口”構(gòu)型，是可以結(jié)合配基的；當(dāng)pH為4.5時，BmorPBP為“開口”構(gòu)型，BmorPBP1的C末端折疊形成第7個α－螺旋并占據(jù)結(jié)合腔內(nèi)部，這被認(rèn)為能夠在PBP／配體復(fù)合物到達氣味受體時促使信息素分子從結(jié)合腔內(nèi)釋放；當(dāng)沒有蠶蛾醇存在時，C末端氨基酸形成α－螺旋替配基的位置占據(jù)結(jié)合腔，而在pH為7.0時C末端并不形成α－螺旋［17－18］。但是由于氨基酸序列的差異，某些昆蟲的蛋白結(jié)構(gòu)會略有不同，如馬德拉蜚蠊（Leucophaea maderae）的OBP的C末端部分很短，進入疏水腔時并不形成α－螺旋，而是與腔內(nèi)的氨基酸形成疏水鍵［19］。雙翅目昆蟲果蠅的LUSH，岡比亞按蚊OBP1，埃及伊蚊OBP1，致倦庫蚊OBP1和膜翅目昆蟲意大利蜜蜂（Apis mellifera）ASP1被稱為中等長度PBP，其序列長度介于鱗翅目昆蟲和蟑螂的氣味結(jié)合蛋白之間，解析這些氣味結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)它們的C端會折疊并進入蛋白核心區(qū)域，但并沒有形成α－螺旋，而且在結(jié)合配體時，C端也沒有被置換出來［4，7，12－13］，通過對華北大黑鰓金龜觸角氣味結(jié)合蛋白OBP2的結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，此蛋白的C末端也屬于后一種情況，即折疊并進入蛋白核心區(qū)域，但并沒有形成α－螺旋，在結(jié)合配體時，C端也沒有被置換出來，由此可以推出，華北大黑鰓金龜觸角氣味結(jié)合蛋白OBP2結(jié)合釋放氣味結(jié)合蛋白的機制與家蠶BmorPBP與信息素的結(jié)合／釋放過程是不同的。

分析蛋白內(nèi)部及蛋白與氣味化合物之間的結(jié)合特性發(fā)現(xiàn)，在HoblOBP2蛋白C末端的α6螺旋上，氨基酸殘基VAL137與CYS133和LYS141分別形成兩對分子內(nèi)氫鍵可以像鎖一樣鎖住苯甲酸己酯。這種特殊的C末端結(jié)構(gòu)在其他一些昆蟲氣味結(jié)合蛋白上也有一些報道，例如：AgamOBP1三維結(jié)構(gòu)的C－末端上Val125分別與His23和Tyr54形成分子內(nèi)氫鍵；對于AmelASP1，在低pH時，靠C末端的Val118與Asp35形成分子內(nèi)氫鍵固定住氣味分子。因此，我們推測在HoblOBP2結(jié)合與釋放氣味分子的過程中，C末端可能起著重要的作用。

毛楊等［7］人對致倦庫蚊氣味結(jié)合蛋白Cqui－OBP1與MOP結(jié)合特點研究時發(fā)現(xiàn)，其相互作用力并不是氫鍵和疏水作用而是范德華力和疏水作用。范德華力（又稱分子作用力）產(chǎn)生于分子或原子之間的靜電引力，沒有方向性和飽和性，其主要作用范圍在1～4?（1?＝0.1nm），與分子間距離的6次方成反比，即隨著分子間距離的增大而迅速減小，距離越近作用力越大。根據(jù)HoblOBP2與苯甲酸己酯的分子對接結(jié)果分析，在與苯甲酸己酯分子距離小于4?的所有殘基中，LEU73（2.10?）是距離最近的，所以LEU73與苯甲酸己酯之間的范德華力是最大的。

通過生物信息學(xué)研究，預(yù)測Leu73、Thr54和Val137均可能與HoblOBP2蛋白特異性結(jié)合氣味分子有關(guān)，至于哪個氨基酸殘基是關(guān)鍵結(jié)合位點，需要進一步通過定點突變技術(shù)，在突變蛋白經(jīng)過體外誘導(dǎo)表達及純化之后進行熒光結(jié)合試驗來驗證。

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