譙 敏，牛司強(qiáng)，王丕龍

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.消化內(nèi)科；2.檢驗(yàn)科 400016）

抑癌基因maspin是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）家族的成員之一，其在健康成人的大多數(shù)組織中均有表達(dá)，而在惡變的組織中表達(dá)明顯下降，甚至不表達(dá)。目前的研究認(rèn)為其可抑制不同類型的腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生長等。為了研究maspin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞的抑制作用，本研究構(gòu)建maspin基因的表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-maspin，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901，從mRNA及蛋白水平檢測maspin的表達(dá)變化，并檢測胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒 pCDNA3.1質(zhì)粒由重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃愛龍教授惠贈(zèng)。

1.1.2 細(xì)胞株和組織 胃癌細(xì)胞株SGC-7901由重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供。原發(fā)性肝癌癌旁組織由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科孔令泉副教授提供。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶XhoⅠ及EcoRⅠ購于TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和連接試劑盒購于Omiga公司；總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒和原位末端標(biāo)記法（TUNEL）反應(yīng)試劑盒購于Promega公司；轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000購于Invitrogen公司；maspin單克隆抗體購于Santa Cruz公司；maspin引物和內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)胃癌SGC-7901細(xì)胞株接種在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，長滿后傳代。

1.2.2 重組質(zhì)粒pCDNA3.1-maspin的構(gòu)建 maspin的上、下游引物分別為5′-TAC GAA TTC ATG GAT GCC CTG CAA CTA GCA AAT-3′和 5′-TCG CTC GAG TTA AGG AGA ACA GAA TTT GCC AAA G-3′。采用手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌癌旁組織，按照Trizol試劑的方法提取總RNA，總RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和maspin下游引物合成第一鏈cDNA，反應(yīng)條件如下：30℃10min，94℃5min，5℃5min。用Ex Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系內(nèi)含cDNA 4 μL，10×緩沖液5μL，上、下游引物各1μL，MgCl 24μL，脫氧核苷酸（dNTPs）4μL，Taq酶0.25μL，加滅菌蒸餾水至50 μL。按下述條件進(jìn)行循環(huán)：94℃40s，57℃30s，72℃70s，共30個(gè)循環(huán)，以純水作陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳30min，EB染色，Bio-Rad圖像儀觀察并掃描制片，膠回收目的基因。重組質(zhì)粒酶切鑒定，再測序分析。

1.2.3 pCDNA3.1-maspin轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞 按lipofectamineTM 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將貼壁生長的SGC-7901細(xì)胞用胰酶消化、離心、然后去上清，沉淀用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整濃度為4×105／mL，2mL／孔細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞生長到占培養(yǎng)瓶底約80%左右時(shí)，培養(yǎng)液換為不含抗菌藥物但仍含血清的RPMI-1640，培養(yǎng)過夜。次日分別用空質(zhì)粒pCDNA3.1、重組質(zhì)粒pCDNA3.1-maspin和脂質(zhì)體的復(fù)合物轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，在無血清及抗菌藥物的培養(yǎng)液中培養(yǎng)4～6h后換新鮮的含10% 小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～4d，然后檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.4 RT-PCR檢測maspin基因的mRNA 按照Qiagen公司的RT-PCR一步法試劑盒進(jìn)行操作。反應(yīng)條件為：94℃40 s，57℃30s，72℃70s，共30個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，以pCDNA3.1轉(zhuǎn)染組作為陰性對照。合成的GAPDH上游引物為：5′-CCA TGG AGA AGG CTG GGG-3′，下游引物為：5′-GGT CCA CCA CTG ACA CTG G-3′，產(chǎn)物長度 421bp；maspin產(chǎn)物長度為821bp。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳30min，EB染色，BIO-RAD圖像分析儀觀察并掃描，記錄結(jié)果。

1.2.5 免疫化學(xué)檢測maspin蛋白表達(dá) SGC-7901細(xì)胞爬片，72h后收獲細(xì)胞，95%乙醇固定后，按maspin抗體說明書操作。DAB顯色，二甲苯透明，封片，照相。Image Proc Plus 3.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖 將SGC-7901細(xì)胞以5×104／mL接種于96孔板，每孔200μL，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h后加上處理因素，每組設(shè)立4個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)1～4d，然后在每孔中加入MTT 20μL，37℃繼續(xù)孵育4h后棄培養(yǎng)液上清，隨后每孔加入二甲基亞砜100 μL，振蕩使藍(lán)色沉淀溶解。用酶標(biāo)儀測490nm波長處的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（IR）及中效濃度，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。抑制率=（l-試驗(yàn)孔A／對照組A）×100%。

1.2.7 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞4×105／mL接種于6孔板，10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)過夜，質(zhì)粒pCDNA3.1和pCDNA3.1-maspin分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后72h，棄上清，95%乙醇固定，3%H2O2封閉，每孔加50 μL反應(yīng)混合液，37℃孵育60min，然后每孔加50mL山羊標(biāo)記的辣根過氧化物酶，DAB顯色。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒鑒定 重組質(zhì)粒pCDNA3.1-maspin經(jīng)XhoⅠ及EcoRⅠ雙酶切，同時(shí)做pCDNA3.1質(zhì)粒雙酶切對照。1%瓊脂糖電泳，pCDNA3.1-maspin經(jīng)雙酶切后呈兩條帶，分別為5.5 kb的載體片段和1 128bp的小片段；而pCDNA3.1經(jīng)雙酶切后則為5.5kb的載體片段和30bp的目的片段。測序結(jié)果均正確。見圖1。

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果 以瓊脂糖電泳條帶的亮度來判斷maspin mRNA水平高低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pCDNA3.1組細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-maspin組細(xì)胞中maspin的mRNA水平上調(diào)80.5%（P＜0.05）。見圖2。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染pCDNA3.1組SGC-7901細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)著色少而淺。而轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-maspin組SGC-7901細(xì)胞可見細(xì)胞質(zhì)黃染，內(nèi)有較多棕黃色顆粒，說明maspin成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入SGC-7901細(xì)胞中并獲得較強(qiáng)表達(dá)。見圖3。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

圖2 RT-PCR檢測maspin的mRNA水平

2.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 純水轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后72h細(xì)胞生長抑制率為0.17±0.03，空質(zhì)粒pCDNA3.1轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后72h細(xì)胞生長抑制率為0.22±0.02，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；重組質(zhì)粒pCDNA3.1-maspin轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后72h細(xì)胞生長抑制率為0.79±0.06，與前兩組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 TUNEL檢測SGC-7901細(xì)胞的凋亡 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染pCDNA3.1組SGC-7901細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)較完整，部分細(xì)胞胞核內(nèi)有著色現(xiàn)象，胞質(zhì)著色淺。而轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-maspin質(zhì)粒組則出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)呈棕紅色染色，核濃縮，胞漿有片狀著色，可見部分細(xì)胞脫落，說明pCDNA3.1-maspin能引起明顯的細(xì)胞凋亡。見圖4。

圖4 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡（×40）

3 討 論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高，惡性程度高。臨床上手術(shù)切除及輔助性放療、化療的應(yīng)用并沒有帶來滿意的生存率［1］。基因治療是近年來興起的一種腫瘤治療的新方法，其中通過基因工程手段促使抑癌基因在癌細(xì)胞中的再表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長，是目前公認(rèn)有效的一種基因治療方法［2-3］。

maspin基因是在人的正常乳腺上皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的serpins。1994年，有研究者首先報(bào)道m(xù)aspin再表達(dá)可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435在體內(nèi)、外的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移［4-5］。Abraham等［6］的研究證明，maspin的再表達(dá)在逆病毒轉(zhuǎn)染的鼠前列腺腫瘤細(xì)胞中能特異性地促進(jìn)細(xì)胞對纖維結(jié)合素的結(jié)合。目前的研究發(fā)現(xiàn)maspin基因在大多數(shù)健康人組織中均有表達(dá)；一旦正常組織惡變，maspin基因表達(dá)則減弱或不表達(dá)［6-10］。生物學(xué)研究表明maspin的再表達(dá)會抑制腫瘤生長，可能與增強(qiáng)細(xì)胞對凋亡刺激因子的敏感性有關(guān)；maspin基因的再表達(dá)可抑制腫瘤浸潤、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移，其發(fā)生可能與maspin介導(dǎo)的抑制細(xì)胞周圍蛋白酶解有關(guān)［11-13］。

在本研究中，作者首先成功構(gòu)建了maspin基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-maspin，將其轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901，并在mRNA和蛋白水平檢測到maspin基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，說明maspin基因在SGC-7901細(xì)胞中獲得了再表達(dá)；同時(shí)MTT實(shí)驗(yàn)及TUNEL反應(yīng)發(fā)現(xiàn)SGC-7901細(xì)胞增殖受到抑制，并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。通過這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者證實(shí)了maspin基因可能通過抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到抑癌作用［14-15］，為進(jìn)一步研究maspin基因的抑癌機(jī)制以及利用maspin基因進(jìn)行基因治療提供了一定的理論依據(jù)。

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