荔 蕊，胡章雪，趙錦寧，汪 麗，劉 蕾，史 源

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所兒科，重慶 400042）

新生兒呼吸窘迫綜合征（neonate respiratory distress syndrome，NRDS）是一類重要的新生兒疾病，病死率高。近年來，國內(nèi)外多家NICU報道足月兒與近足月兒NRDS患病率增加，且具備不同于早產(chǎn)兒NRDS的臨床特征［1-3］。妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）母親所分娩之足月新生兒患NRDS的發(fā)病率顯著增加［4-5］，機(jī)制不清楚。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar type 2epithelium cell，AECⅡ）是合成與分泌肺表面活性物質(zhì)（pulmonary surfactant，PS）的主要場所，AECⅡ凋亡增加將導(dǎo)致PS持續(xù)分泌不足，肺泡塌陷、萎縮，繼而發(fā)生NRDS。作者的前期研究發(fā)現(xiàn)：膽酸的主要成分之一甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholate，GCDC）對AECⅡ具有誘導(dǎo)凋亡和壞死的作用，而且可顯著減少AECⅡ中肺泡表面活性物質(zhì)的合成。NO是一種可溶性氣體，可由L-精氨酸在一氧化氮合酶催化下產(chǎn)生。在病理狀態(tài)下，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是 NO大量生成的關(guān)鍵酶，具有重要意義。iNOS／NO與低濃度外源性NO對于細(xì)胞凋亡具有抑制作用，臨床多中心研究發(fā)現(xiàn)，對嚴(yán)重呼吸衰竭的新生兒使用NO吸入治療，顯著降低了外源性PS和高頻機(jī)械通氣的使用率［6］。機(jī)械通氣初期開始使用NO吸入治療效果明顯好于呼吸衰竭嚴(yán)重時再使用［7］。上述臨床現(xiàn)象強(qiáng)烈提示NO具備降低肺動脈高壓之外的其他治療作用，聯(lián)系到項目組發(fā)現(xiàn)NRDS中AECⅡ的凋亡對呼吸衰竭的重要影響，以及NO可能具備抗GCDC誘導(dǎo)AECⅡ凋亡的作用，NO極有可能通過抑制AECⅡ凋亡而產(chǎn)生了對NRDS的上述治療作用。本研究擬通過細(xì)胞試驗檢測甘氨鵝脫氧膽酸誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡模型中一氧化氮合酶的表達(dá)變化，以及外源性NO對細(xì)胞凋亡的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肺癌上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞所。

1.1.2 儀器與試劑 PRMI 1640培養(yǎng)基 （美國GIBCO公司）；小牛血清 （美國GM公司）；甘氨鵝脫氧膽酸鹽 （sigma公司）；胰酶細(xì)胞消化液 （碧云天生物技術(shù)研究所）；caspase-3試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；一氧化氮合酶抗體及一氧化氮供體SNAP（美國Sigma公司）。

1.2 方法 （1）細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出存有A549細(xì)胞的凍存管，放于37℃溫水中，用鑷子住輕輕搖動使其迅速融化。1000～2 000r／min，3～5min離心。在無菌操作臺中采用75%的乙醇徹底擦拭凍存管，然后打開凍存管，注意動作要輕柔。用1mL槍頭將上清液去除，加入1mL預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞吹散開，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中。補(bǔ)充4mL的RPMI 1640培養(yǎng)基，并且添加10%的胎牛血清。倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養(yǎng)。24h后，更換新的培養(yǎng)液。細(xì)胞復(fù)蘇后常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞呈對數(shù)期生長后用于實驗。（2）甘氨鵝脫氧膽酸誘導(dǎo)經(jīng)典的凋亡途徑，采用熒光免疫實驗。在24孔板中放入小玻片，進(jìn)行細(xì)胞爬片，將細(xì)胞分為兩組，一組加入200μmol／L GCDC，一組做空白對照。先使用caspase-3染色試劑盒對caspase-3染色熒光倒置下呈紅色，再DAPT染細(xì)胞核熒光倒置顯微鏡下呈藍(lán)色。分別拍照后，重合在一起，顯紫紅色為依賴caspase-3途徑的細(xì)胞凋亡。（3）細(xì)胞凋亡采用caspase-3檢測試劑盒進(jìn)行檢測采用蛋白印跡法（Western Blot）方法檢測一氧化氮合酶表達(dá)水平，NO供體SNAP與膽酸共處理A549細(xì)胞以判斷其對細(xì)胞凋亡的作用。收集細(xì)胞，PBS洗滌，抽提細(xì)胞裂解液，蛋白定量，SDS-PAGE電泳，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉，室溫靜置1.5～2 h，caspase-3多抗室溫反應(yīng)1～2h，TBS（含0.05%Tween 20的TBS）洗3次，5～10min／次，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1～2h，TBS-T洗3次，5～10min／次，NBT／BCIP顯色。

2 結(jié) 果

2.1 GCDC誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡 為了進(jìn)一步確定甘氨鵝脫氧膽酸能否誘導(dǎo)經(jīng)典的凋亡途徑，進(jìn)行了熒光免疫實驗。結(jié)果顯示，甘氨鵝脫氧膽酸處理后的A549出現(xiàn)了明顯的凋亡。使用caspase-3染色試劑盒對caspase-3染色呈紅色，DAPT染細(xì)胞核呈藍(lán)色，圖1中上圖為200μmol／L GCDC處理組，下圖為空白對照組，結(jié)果證明GCDC可誘導(dǎo)A549細(xì)胞依賴caspase-3途徑凋亡。見圖1。

2.2 GCDC抑制A549中iNOS表達(dá) 不同濃度GCDC處理A549后，細(xì)胞中iNOS的蛋白表達(dá)水平明顯降低，且具有濃度依賴性。實驗證明，GCDC可抑制iNOS在細(xì)胞中的表達(dá)水平，當(dāng)GCDC濃度達(dá)到1 000μmol／L時，iNOS表達(dá)明顯受到抑制，GCDC濃度與抑制iNOS程度正相關(guān)。見圖2。

圖2 GCDC處理AECⅡ后iNOS的表達(dá)變化情況

2.3 外源性NO抑制GCDC誘導(dǎo)的A549凋亡 以NO供體SNAP（0～1mmol／L）單獨(dú)處理 AECⅡ時，細(xì)胞不發(fā)生凋亡；GCDC可誘導(dǎo)AECⅡ凋亡，但用SNAP和GCDC共處理AECⅡ后則降低了細(xì)胞的凋亡程度。見圖3。

圖3 NO供體SNAP與對GCDC誘導(dǎo)AECⅡ凋亡的影響

3 討 論

ICP主要臨床表現(xiàn)為皮膚瘙癢、黃疸及肝功能異常，可導(dǎo)致孕婦和胎兒的并發(fā)癥。ICP主要危害胎兒，可致胎兒宮內(nèi)窘迫、流產(chǎn)、死胎等，增高圍產(chǎn)兒發(fā)病率和死亡率。ICP最常發(fā)生在孕晚期，但在妊娠期間也可以隨時發(fā)病。ICP對孕婦的影響不大，但是對胎兒有很大影響，有研究顯示與正常妊娠相比，ICP患者臍帶血孕激素重硫酸化代謝產(chǎn)物含量高，胎兒類固醇硫酸鹽水平合成量降低，使胎兒類固醇合成功能受損。1883年就報道了ICP，描述ICP為妊娠期間復(fù)發(fā)性黃疸，分娩后消失。很多研究證實激素在ICP治病機(jī)制中起著重要作用。ICP最常見于經(jīng)產(chǎn)婦，在經(jīng)產(chǎn)婦與初產(chǎn)婦的發(fā)病率分別為20.0%和4.7%。ICP通常發(fā)生于懷孕的后3個月，為雌激素水平的高峰時期有ICP家族史的婦女，服用避孕藥后也會出現(xiàn)ICP的臨床癥狀。黃體酮及代謝產(chǎn)物也可能是發(fā)病機(jī)制，Bacq等［8］做了臨床實驗，12例先兆早產(chǎn)患者有11例有服用過天然孕激素治療。

NRDS又稱為肺透明膜病（hyaline membrane disease，HMD），是由PS缺乏而導(dǎo)致，以出生后不久便出現(xiàn)呼吸窘迫呈進(jìn)行性加重的綜合征，是新生兒重癥監(jiān)護(hù)室常見的危急重癥，發(fā)病率及病死率高［9］，臨床癥狀以呼吸急促困難、呻吟為主要表現(xiàn)。PS是由AECⅡ合成分泌的磷脂蛋白復(fù)合物，胎兒在18～20周AECⅡ已經(jīng)能夠分泌少量的PS轉(zhuǎn)移至肺泡表面，隨胎齡增長，PS的合成分泌量增高，所以本病易發(fā)生于早產(chǎn)兒，胎齡越小，發(fā)病率越高，足月兒與近足月兒（胎齡大于或等于35周）的發(fā)病率是較低的［3］。近年來，國內(nèi)外多家NICU報道足月兒與近足月兒NRDS患病率增加，且具備不同于早產(chǎn)兒NRDS的臨床特征［1-2，10］，所以早產(chǎn)并不是PS分泌不足致NRDS的主要原因。圍生期窒息、前置胎盤、胎盤早剝及孕婦低血壓致胎兒血容量下降等均能誘發(fā)胎兒的呼吸窘迫癥。最新的研究表明，母親患有ICP時，胎兒NRDS發(fā)病概率顯著增高。

膽汁酸對孕婦和胎兒的毒性作用，妊娠中晚期胎兒和母體合成的膽汁酸都是通過胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的，Ding等［11］發(fā)現(xiàn)膽汁酸可能損害細(xì)胞器從而導(dǎo)致多核細(xì)胞生理功能失常，影響胎盤合成和轉(zhuǎn)運(yùn)功能。孕婦膽汁酸升高，可導(dǎo)致胎盤絨毛間隙狹窄，胎盤灌注量減少；膽汁酸有濃度依賴性血管收縮作用，高濃度膽汁酸使絨毛血管痙攣，從而導(dǎo)致胎盤灌注不足，發(fā)生胎兒窘迫。膽汁酸通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)后，其細(xì)胞毒作用破壞線粒體膜產(chǎn)生氧自由基，從而導(dǎo)致胎兒的氧利用障礙［12］。膽酸鹽可刺激腸蠕動，但是膽酸過高，便會造成羊水胎糞污染。各種炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)積聚、黏附、激活同時釋放大量的活性氧和蛋白酶，直接或間接引起胎兒的肺損傷，從而增加新生兒窒息，及吸入性肺炎的概率，患NRDS的風(fēng)險明顯升高［13］。

本實驗通過研究一氧化氮抑制甘氨鵝脫氧膽酸誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，為預(yù)防和治療NRDS尋找新的治療方法和藥物靶點，從而降低NRDS的發(fā)生率。

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