熊祺琰，紀(jì) 燕，劉占軍，馬慶紅，馮志新，劉茂軍，白方方，邵國青

豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）（以下簡寫為Mhr）是一種能夠引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎、肺炎等病癥的致病性支原體［1－4］。Mhr在臨床豬場的感染率較高，通常由母豬或大豬傳染給小豬，主要通過上呼吸道感染傳播，該病原從呼吸系統(tǒng)向全身發(fā)生侵染將導(dǎo)致多漿膜炎、關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生。Mhr也是細胞培養(yǎng)中引起培養(yǎng)污染的最常見支原體［5］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)Mhr感染與人的多種癌癥，包括胃癌、大腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等有明顯的相關(guān)性［6－9］。目前臨床上 Mhr的感染檢測主要依賴于PCR方法，尚未有商品化試劑盒用于血清學(xué)檢測。

支原體的基因組相對較小，缺乏細胞壁結(jié)構(gòu)，在多種支原體的基因組中都含有多個編碼表面可變脂蛋白的基因，其功能主要通過改變脂蛋白種類及大小來改變支原體表面的抗原性，幫助支原體逃避宿主的免疫系統(tǒng)識別，從而在不同宿主中實現(xiàn)持續(xù)感染。Mhr中發(fā)現(xiàn)的表面可變脂蛋白為vlp（variable lipoprotein，vlp）［10－11］，目前發(fā)現(xiàn)的 Mhr vlp家族成員共有7個，分別為vlpA－vlpG。本研究擬構(gòu)建表達一種重組蛋白，包含vlpA－vlpG的主要表位，該重組蛋白可用于建立Mhr的血清學(xué)診斷方法，及用于開發(fā)Mhr重組蛋白疫苗。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1．1．1 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌 BL－21（DE3）及表達質(zhì)粒載體pET－32a（＋）均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1．1．2 材料與試劑 硝酸纖維素膜，美國 Millipore公司；鎳柱，金斯瑞生物科技公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG，美國Bethyl公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色液，武漢博士德公司；基因合成，金斯瑞生物科技公司。Mhr陽性兔血清，實驗室自制，用Mhr全菌滅活抗原免疫5只健康新西蘭大白兔，免疫3次每次間隔2周，第3次免疫后2周采血；Mhr陽性豬血清，實驗室自制，用Mhr全菌滅活抗原免疫3頭健康豬，免疫3次每次間隔2周，第3次免疫后2周采血。

1．2 試驗方法

1．2．1 vlpA－G蛋白設(shè)計 在GenBank上檢索vlp家族成員序列，用blast分析蛋白片段的Mhr特異性，并分析各自的重復(fù)區(qū)序列。為維持表位的完整性，vlpB－vlpG蛋白的重復(fù)區(qū)都采用2段重復(fù)片段。各個序列之間添加柔性片段GGGGS作為連接肽。由于vlpA可能僅含有兩段重復(fù)區(qū)片段并間隔較遠，故僅取一段vlpA的重復(fù)片段，以GGGGS為連接肽串聯(lián)在vlpB－G的C端，設(shè)計得到重組蛋白vlpA－G。

1．2．2 重組蛋白vlpA－G表達質(zhì)粒的構(gòu)建 采用基因合成的方式獲得表達vlpB－G的基因序列，同時利用大腸桿菌偏愛的密碼子進行序列優(yōu)化以幫助表達。兩端分別添加EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點。合成的基因片段經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后插入pET－32a（＋）空質(zhì)粒載體中，構(gòu)建得到 pET32avlpB－G重組表達質(zhì)粒。

在vlpB－G序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)GenBank中登錄的vlpA序列（登錄號為AF193874．1）設(shè)計引物擴增vlpA基因重復(fù)片段放入vlpB－G的C端，其間加入GGGGS作為連接肽。具體方法為：以vlpB－G基因為模板用下游兩次加端PCR的方法擴增得到vlpA－G基因，C端加入HindⅢ酶切位點。PCR引物分別為：上游引物，5′－AAAGAATTCGGCGGTGGCGGCTCGGGCACGGGCTCGGATTCTCAG 3′；下游引物－1，5′－TGCGTATTTTCGGTTTTCG AGCCGCCACCGCCGCTGTCTGCCTGACCGCT GCTTT 3′；下游引物－2，5′－CCGAAGCTTAGGTGCCCGGCGCCTCGCTTTGCTGCGTATTTTCG GTTTTCGAGCC 3′。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后插入pET－32a（＋）空質(zhì)粒載體中，構(gòu)建得到表達vlpA－G的重組質(zhì)粒pET32a－vlpA－G。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，用上游引物和下游引物－2PCR篩選陽性克隆，得到的陽性克隆進行一次單克隆，再重復(fù)篩選一次，獲得陽性菌株，測序鑒定序列的正確性。制備甘油管保存菌種。

1．2．3 重組vlpA－G蛋白的表達 接種20μL甘油管菌液至5mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)得到種子液，次日將種子液以2%的量轉(zhuǎn)接至氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600值為0．4～0．6，加IPTG至終濃度1mmol／L，37℃誘導(dǎo)，于不同時間點收集菌體，進行SDS－PAGE（15%分離膠、5%濃縮膠），測定最佳誘導(dǎo)時間。

1．2．4 重組vlpA－G蛋白的制備及純化 同上接種，并于上述摸索的最佳誘導(dǎo)時間點收集菌體，超聲裂解菌體，離心收集上清，鎳柱親和層析純化。

1．2．5 Western Blot檢測 Mhr抗體 蛋白經(jīng)SDS－PAGE分離，用半干轉(zhuǎn)印法（Tris－Gly緩沖系統(tǒng)，0．65mA／cm2，轉(zhuǎn)印1．5h）轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC）上。5%脫脂奶室溫或37℃搖動封閉2h，加入用1% 脫脂奶粉，10mmol／L PBS稀釋40倍的Mhr陽性兔血清，37℃搖動雜交1h。0．05%Tween－20，10mmol／L PBS洗膜5次，每次5min。洗滌后加入用1% 脫脂奶粉，10mmol／L PBS稀釋5 000倍的羊抗兔酶標(biāo)二抗，37℃作用1h。同上洗滌后加入顯色液，出現(xiàn)明顯條帶后用蒸餾水沖洗膜以終止反應(yīng)。

1．2．6 間接ELISA方法建立 取純化的重組vlpA－G蛋白，考馬斯亮藍試劑盒測定蛋白濃度。用包被稀釋液0．05mmol／L Na2CO3－NaHCO3緩沖液（pH 9．6）將蛋白稀釋至為5μg／mL，每孔加100 μL，4℃包被過夜，次日用含0．05%Tween－20的PBST溶液洗滌3次，每次5min；每孔加200μL 3%BSA于37℃封閉2h，同上洗滌3次；加入1∶100倍稀釋的Mhr抗體陽性豬血清或陰性血清樣本，每孔100μL，置37℃孵育1h，洗滌；加入1∶8 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG二抗，每孔100μL，置37℃孵育1h，洗滌；加新鮮配制的TMB底物100μL，37℃避光顯色10min；加入50μL 2 mol／L H2SO4終止反應(yīng)，于450nm波長測定。

2 結(jié) 果

2．1 vlpA－G蛋白設(shè)計 在GenBank上檢索vlp家族成員序列，7種vlp蛋白vlpA、vlpB、vlpC、vlpD、vlpE、vlpF、vlpG結(jié)構(gòu)及重復(fù)片段區(qū)代表性示意圖如圖1。

圖1 vlp家族蛋白Fig．1 The vlp family protein

經(jīng)Blast分析發(fā)現(xiàn)vlp蛋白都具有較強的Mhr特異性，適合作為檢測抗原使用。將vlpB、vlpC、vlpD、vlpE、vlpF、vlpG各自的2段重復(fù)片段串聯(lián)，之間添加柔性片段GGGGS作為連接肽，設(shè)計重組蛋白vlpB－G（圖2A）。取vlpA的一段重復(fù)片段串聯(lián)至vlpB－G的C端，中間添加柔性片段GGGGS作為連接肽，設(shè)計得到重組蛋白vlpA－G。具體蛋白序列如圖2B所示。

圖2 重組vlpA－G蛋白設(shè)計及其序列Fig．2 Design and sequence of the recombinant vlpA－G protein

2．2 重組表達質(zhì)粒pET32a－vlpA－G的構(gòu)建 采用基因合成的方式獲得串聯(lián)表達vlpB－vlpG重復(fù)區(qū)多肽的基因序列，用加端PCR方法將vlpA重復(fù)片段基因串聯(lián)至vlpB－G基因C端，插入pET32a－vlpB－G重組質(zhì)粒中，構(gòu)建得到表達vlpA－G的重組質(zhì)粒pET32a－vlpA－G。用vlpA－G上下游引物進行PCR篩選（圖3），挑選陽性克隆，經(jīng)單克隆后DNA測序，測序結(jié)果正確。制備甘油管保存菌種。

圖3 重組表達質(zhì)粒pET32a－vlpA－G的鑒定1．DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2．陰性對照；3．vlpA－G基因擴增產(chǎn)物Fig．3 Identification of the recombinant plasmid expressing vlpA－G1：DNA molecular weight markers；2：Negative control；3：PCR product of vlpA－G gene

2．3 重組蛋白vlpA－G的表達及分離純化 IPTG誘導(dǎo)后重組vlpA－G蛋白可以在大腸桿菌中有效地表達，在分子量為50kDa與90kDa的標(biāo)準(zhǔn)條帶位置中間偏50kDa處有顯著加深的蛋白帶。IPTG誘導(dǎo)后不同時間取樣，發(fā)現(xiàn)加入IPTG誘導(dǎo)6h后蛋白的表達達到高峰并處于穩(wěn)定水平，故選擇誘導(dǎo)6h后收集菌體。采用鎳柱親和純化重組vlpA－G蛋白，結(jié)果見圖4。對蒸餾水透析后凍干保存于－20℃。

2．4 Western Blot檢測 Mhr抗體 將純化的vlpA－G重組蛋白以及pET－32a（＋）空載體表達純化蛋白電泳分離后用Mhr抗血清進行 Western Blot檢測，結(jié)果可見vlpA－G重組蛋白可與Mhr陽性兔血清產(chǎn)生明顯雜交條帶，而pET－32a（＋）空載體表達純化蛋白與Mhr陽性兔血清無雜交反應(yīng)，說明重組vlpA－G蛋白具有明顯的Mhr抗體反應(yīng)原性。以未免疫健康兔血清為陰性對照，未發(fā)現(xiàn)雜交條帶。

2．6 間接ELISA檢測Mhr抗體 以重組蛋白vlpA－G為包被抗原檢測Mhr免疫豬血清，以未免疫健康豬血清為陰性對照。結(jié)果表明Mhr免疫豬血清中可檢測到明顯的Mhr抗體，與陰性血清相比差異極顯著，說明該重組vlpA－G蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可作為候選抗原蛋白用于血清學(xué)診斷方法的后續(xù)研究。

圖4 重組vlpA－G蛋白的表達純化1．蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2．pET32a－vlpA－G 重組菌誘導(dǎo)后；3．pET－32a（＋）空載體對照菌誘導(dǎo)后；4．純化的vlpA－GFig．4 Expression and purification of the recombinant vlpA－G protein1：Protein molecular weight markers；2：Total protein of E．coli BL－21containing pET32a－vlpA－G after induction；3：Total protein of E．coli BL－21containing pET－32a（＋）after induction；4：Purified vlpAG protein

3 討 論

Mhr是第一種從豬體內(nèi)分離到的支原體，主要通過呼吸道感染傳播，但目前Mhr的研究較少，其具體的致病機制尚不清楚，可能通過黏附到纖毛細胞上進而侵入機體［12－13］，同時 Mhr對纖毛的損傷也為其他病原菌的感染提供便利從而導(dǎo)致共感染的發(fā)生。除了引起天然宿主豬的疾病外，Mhr也被發(fā)現(xiàn)與多種人類腫瘤相關(guān)。早在上世紀(jì)90年代人們就注意到某些支原體的感染與人類腫瘤之間存在著一定的相關(guān)性，其中包括 Mhr。Mhr的一種膜蛋白P37被證明與細胞腫瘤化有直接關(guān)系［8，14］，是目前唯一鑒定出的Mhr腫瘤相關(guān)抗原。

目前，豬群Mhr感染的診斷手段主要包括分離培養(yǎng)、PCR［15］、免 疫 組 化［16］及 原 位 雜 交［3］。 利 用PCR檢測16sRNA、P37基因建立PCR方法能夠較為靈敏地檢測Mhr，并能與豬滑液支原體、豬肺炎支原體區(qū)別開來。但活體動物的PCR通常使用鼻拭子及支氣管肺泡灌洗液作為待檢樣本。其中鼻拭子樣本檢出率較低，通常只能用于群體感染性的判斷，而對于個體發(fā)病而言容易出現(xiàn)假陰性。支氣管肺泡灌洗液雖然可以通過麻醉動物后利用纖維支氣管鏡等儀器實現(xiàn)活體采集，但是難以應(yīng)用于臨床進行大規(guī)模采樣。免疫組化及原位雜交方法雖然也可以特異性地檢測豬體內(nèi)的Mhr，但是同樣都需要剖殺動物檢查。血清學(xué)檢測是臨床主要依賴的檢測手段。劉星等報道利用Mhr特異性的單抗建立阻斷ELISA方法可用于檢測血清中Mhr［17］。

圖5 重組蛋白vlpA－G Western Blot檢測 Mhr血清抗體A：麗春紅染色結(jié)果；B：Western blot雜交結(jié)果1－3．Mhr陽性血清雜交；4－6．Mhr陰性血清雜交1、4泳道，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、5泳道，轉(zhuǎn)化pET－32a（＋）空載體的工程菌純化表達蛋白；3、6泳道，純化重組蛋白vlpA－G．Fig．5 Detection of serum antibody against Mhr by recombinant vlpA－G protein in Western blot assayA：Stained by poncean before hybridization；B：Result of Western blot1－3：Hybridized with Mhr positive serum；4－6：Hybridized with Mhr negative serum；1and 4：Protein molecular weight markers；2and 5：Purified protein of E．coli BL－21containing pET－32a（＋）after induction；3and 6：Purified recombinant vlpA－G protein．

圖6 重組蛋白vlpA－G ELISA檢測Mhr血清抗體Fig．6 Detection of serum antibody against Mhr by the ELISA assay using recombinant vlpA－G protein as coating antigen

本研究利用Mhr vlp可變脂蛋白家族為靶蛋白，構(gòu)建重組蛋白擬作為ELISA包被抗原使用。Mhr vlp家族蛋白結(jié)構(gòu)類似都由3部分構(gòu)成［10－11］：I區(qū)為信號肽區(qū)域，7種vlp蛋白的信號肽區(qū)序列完全相同；II區(qū)為相對保守的過渡區(qū)，III區(qū)為重復(fù)片段區(qū)，由12～13個氨基酸的短肽片段串聯(lián)重復(fù)而成，重復(fù)次數(shù)2～11個不等，7種vlp蛋白重復(fù)序列各不相同，少數(shù)vlp蛋白在重復(fù)片段之間存在連接序列。在不同菌株及同一菌株傳代過程中vlp蛋白家族表達的數(shù)量、種類和分子量大小各不相同，這種表達差異使得Mhr具有多變的表面抗原性，在免疫逃避中起到關(guān)鍵作用。vlp家族蛋白作為Mhr的表面脂蛋白，是建立血清學(xué)診斷方法的理想抗原，同時表面蛋白通常也具有較好的免疫原性，因此也適合作為重組疫苗的候選蛋白。介于vlp家族蛋白本身的表達變異性，在本研究中設(shè)計的vlpA－G串聯(lián)表達了vlp家族7種蛋白的重復(fù)片段，囊括了目前已知的vlp家族的所有成員的主要免疫區(qū)段，可以對廣泛的Mhr菌株產(chǎn)生反應(yīng)。在試驗過程中我們發(fā)現(xiàn)表達出來的vlpA－G蛋白的分子量大于50kDa，而設(shè)計的重組蛋白理論分子量應(yīng)為36．8kDa，另一方面，DNA測序結(jié)果卻顯示所設(shè)計的vlpA－G基因序列正確地插入到pET－32a（＋）載體中。其分子量與預(yù)期不符的原因可能與vlp蛋白本身的功能和性質(zhì)有關(guān)，在其他支原體的一些黏附蛋白上也報道過這種現(xiàn)象［18］。

本研究結(jié)果證明，重組vlpA－G可以在大腸桿菌中很好地表達，以其為包被抗原初步建立ELISA方法能夠明顯地檢測到Mhr的陽性血清。本結(jié)果將為Mhr血清或黏膜抗體間接ELISA檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

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