鄭 斌，尹志奎，詹希美

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性的細胞內(nèi)寄生原蟲，在宿主細胞內(nèi)繁殖以及破壞宿主細胞，引起致病。弓形蟲的入侵機制目前尚未闡明，微線體蛋白（microneme protein，MIC）、菱形體蛋白（rhomboid，ROM）和肌動蛋白（actin）等都參與了弓形蟲主動入侵宿主細胞的過程［1－3］。若能利用蛋白相互作用技術(shù)，以已知入侵蛋白來探尋一些未知的作用蛋白，則有助于揭示弓形蟲的入侵機制。我們在前期的研究中采用GST pull－down技術(shù)已篩選到 MIC6羧基端（MIC6C）的作用蛋白［4］，本文利用免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）技術(shù)對前期研究的初篩結(jié)果進行鑒定，并提供細胞定位上的依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 弓形蟲株和主要儀器 弓形蟲RH株為中山大學中山醫(yī)學院寄生蟲學教研室傳代保種；Olympus研究型生物熒光顯微鏡（BX51，日本）；SPOT彩色面陣CCD（分辨率為1 600×1 200pixel，美國）；圖像采集卡（CCD附件，美國）。

1．2 主要試劑 硝酸纖維素膜（NC）購自美國PALL公司；免疫共沉淀用 protein G／protein A sepharose購自美國Calbiochem公司；兔免疫前血清、兔源性 GST－MIC6C多克隆抗體（效價1∶8 000）、鼠源性 GST－MIC6C多克隆抗體（效價1∶4 000）、鼠源性醛縮酶－His6多克隆抗體（效價1∶4 000）、鼠源性 Actin－His6多克隆抗體（效價1∶4 000）和兔源性GST－MIC2C多克隆抗體（效價1∶8 000）為本實驗室前期制備；免疫印跡增強化學發(fā)光法（ECM）試劑盒（大鼠IgG）購自美國Promega公司；X感光膠片為Kodak產(chǎn)品；顯影液、定影液、兔抗大鼠IgG－HRP和熒光二抗（羊抗兔IgGTRITC、兔抗大鼠IgG－FITC）購自武漢博士德公司。

1．3 免疫共沉淀實驗（immunoprecipitation，IP）制備弓形蟲速殖子裂解液［4］。分別取100μL免疫共沉淀用protein G plus／protein A sepharose于2支1．5mL Eppendorf管中，分別加入100μL兔源性GST－MIC6C多克隆抗體和兔免疫前血清，4℃緩慢旋轉(zhuǎn)結(jié)合1h。離心，4 000r／min×4min，棄上清，PBS重懸。PBS洗2次，最后1次用Buffer A（50mmol／L KCl，10mmol／L HEPES，pH 7．7，1 mmol／L MgCl2，1mmol／L EDTA，2mmol／L ATP，0．2%Tween－20）洗滌。分別加入600μL弓形蟲速殖子裂解液，4℃緩慢旋轉(zhuǎn)結(jié)合12h。離心，4 000r／min×4min，棄上清，Buffer A洗滌5次。4×SDS凝膠加樣緩沖液重懸sepharose，100℃加熱5min，SDS－PAGE，轉(zhuǎn) NC 膜，分別用大鼠源性GST－MIC6C多克隆抗體、醛縮酶－His6多克隆抗體和Actin－His6多克隆抗體為一抗。兔抗大鼠IgGHRP為二抗溫育NC膜，常規(guī)漂洗后，免疫印跡增強化學發(fā)光法（ECM）檢測NC膜。

1．4 間接免疫熒光定位

1．4．1 MIC6蛋白和醛縮酶蛋白在弓形蟲體內(nèi)的定位 新鮮收集的弓形蟲速殖子，PBS洗3次，涂片，室溫下晾干。3．7%多聚甲醛（多聚甲醛3．7g，加蒸餾水50mL，加熱至60℃，攪拌并加入1mol／L NaOH數(shù)滴，直至溶液變清，冷卻后用0．1mol／L pH 7．4PBS加至100mL）固定，室溫20min。PBS－Ca2＋液（CaCl21．11g，PBS 100mL）洗5次，室溫下封閉液（5%BSA，0．25%Triton－100）封閉1h。PBS洗5次。滴加一抗液（兔源性GST－MIC6C多克隆抗體、鼠源性醛縮酶－His6多克隆抗體），37℃濕盒溫育1h。PBS洗5次。滴加熒光二抗（羊抗兔IgG－TRITC），37℃濕盒溫育1h。PBS洗5次。滴加熒光二抗（兔抗大鼠IgG－FITC），37℃濕盒溫育1 h。PBS洗5次，室溫下晾干。熒光顯微鏡油鏡下觀察并拍照。

1．4．2 MIC2蛋白（陽性對照蛋白）和醛縮酶蛋白在弓形蟲體內(nèi)的定位 一抗液為兔源性GSTMIC2C多克隆抗體和鼠源性醛縮酶－His6多克隆抗體，余同方法1．4．1。

2 結(jié) 果

2．1 免疫共沉淀實驗鑒定MIC6C的作用蛋白免疫共沉淀產(chǎn)物SDS－PAGE后，轉(zhuǎn)NC膜，分別用大鼠源性GST－MIC6C多克隆抗體、醛縮酶－His6多克隆抗體和Actin－His6多克隆抗體為一抗。兔抗大鼠IgG－HRP為二抗溫育NC膜，常規(guī)漂洗后，ECM檢測NC膜。在GST－MIC6C多克隆抗體的IP產(chǎn)物中，有3個蛋白條帶可分別被大鼠源性GSTMIC6C多克隆抗體、醛縮酶－His6多克隆抗體（antialdolase）和 Actin－His6多克隆抗體（anti－actin）識別，而在免疫前血清的IP產(chǎn)物中未檢測到蛋白條帶（圖1）。

圖1 免疫共沉淀實驗產(chǎn)物的Western blot分析Fig．1 Western blot analysis of products from immunoprecipitation1：T．gondii lysate；2：The IP experiment products of anti－GST－MIC6C；3：The IP experiment products of preimmune serum

2．2 MIC6蛋白和醛縮酶蛋白在弓形蟲體內(nèi)的間接熒光定位 新鮮弓形蟲速殖子涂片，多聚甲醛固定，封閉液封閉。一抗液（兔源性GST－MIC6C多克隆抗體、鼠源性醛縮酶－His6多克隆抗體）常規(guī)溫育、漂洗，先滴加羊抗兔IgG－TRITC熒光二抗，溫育、漂洗，再滴加兔抗大鼠IgG－FITC熒光二抗，溫育、漂洗，室溫下晾干。熒光顯微鏡下觀察。首先在自然光源下觀察玻片上蟲體，拍照。更換到熒光光源，F(xiàn)ITC在495nm激化，525nm發(fā)射熒光，呈綠色熒光。拍照。TRITC最大吸收光譜550nm，發(fā)射光譜600～620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光。SPOT 4．0．2和Photoshop 8．0分析圖像。在蟲體的頂端可觀察到紅色熒光（MIC6蛋白）和綠色熒光（醛縮酶蛋白）（圖2）。

2．3 MIC2蛋白（陽性對照蛋白）和醛縮酶蛋白在弓形蟲體內(nèi)的間接熒光定位 一抗液采用兔源性GST－MIC2C多克隆抗體、大鼠源性醛縮酶－His6多克隆抗體，熒光二抗同上，熒光顯微鏡下觀察并拍照。SPOT 4．0．2和 Photoshop 8．0分析圖像。在蟲體的頂端可觀察到紅色熒光（MIC2蛋白）和綠色熒光（醛縮酶蛋白）（圖3）。

圖2 MIC6蛋白和醛縮酶蛋白在弓形蟲頂端的定位Fig．2 MIC6and aldolase are apically localized in T．gondii MIC6was localized using rabbit anti－MIC6Cand goat anti－rabbit conjugated to TRITC （red）；aldolase was visualized using rat anti－aldolase and rabbit anti－rat conjugated to FITC （green）

圖3 MIC2蛋白和醛縮酶蛋白在弓形蟲頂端的定位Fig．3 MIC2and aldolase are apically localized in T．gondii MIC2was localized using rabbit anti－MIC2Cand goat anti－rabbit conjugated to TRITC （red）；aldolase was visualized using rat anti－aldolase and rabbit anti－rat conjugated to FITC （green）

3 討 論

弓形蟲的 MIC6和 MIC1、MIC4組成 MIC6－MIC1－MIC4復合體參與蟲體的入侵過程。MIC1具有凝集素特性，在識別、粘附宿主細胞中發(fā)揮重要作用［5］；MIC4有6個富含半胱氨酸的蘋果模序（apple motif）結(jié)構(gòu)，其第5個蘋果模序具有潛在的半乳糖粘合特性，很可能干預(yù)宿主的免疫保護過程［6］。MIC6的氨基端（N端）通過 MIC1連接 MIC4，MIC6的跨膜區(qū)將 MIC6－MIC1－MIC4復合體固定于膜上，經(jīng)初步篩選，MIC6的羧基端（MIC6C）與醛縮酶作用參與蟲體入侵［4］。該作用蛋白為GST pull－down技術(shù)篩選獲得，為排除 GST pull－down技術(shù)有時會因蛋白質(zhì)的電荷、第三者的中介等產(chǎn)生假陽性結(jié)果，有必要采用其它的蛋白作用技術(shù)來鑒定MIC6C的作用蛋白。

免疫共沉淀實驗的結(jié)果表明在自然狀態(tài)下與MIC6C端作用的蛋白是醛縮酶，即無論在蟲體內(nèi)（免疫共沉淀的結(jié)果）或蟲體外（GST pull－down的結(jié)果），MIC6C與醛縮酶都存在相互作用；此結(jié)果也與Jewett等的結(jié)論相符［7］。MIC6和醛縮酶的間接免疫熒光定位顯示兩蛋白共定位于蟲體的頂端，為MIC6和醛縮酶相互作用的確立提供了細胞定位學上的證據(jù)。至于MIC6和醛縮酶的作用位點如何則有待于進一步的研究。

［1］Dowse TJ，Pascall JC，Brown KD，etal．Apicomplexan rhomboids have a potential role in microneme protein cleavage during host cell invasion［J］．Int J Parasitol，2005，35（7）：747－756．DOI：10．1016／j．ijpara．2005．04．001

［2］Santos JM，Graindorge A，Soldati－Favre D．New insights into parasite rhomboid proteases［J］．Mol Biochem Parasitol，2012，182（1／2）：27－36．DOI：10．1016／j．molbiopara．2011．11．010

［3］Daher W，Klages N，Carlier MF，etal．Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3，an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility［J］．Eukaryot Cell，2012，11（3）：343－352．DOI：10．1128／EC．05192－11

［4］Zheng B，Yin ZK，He A，etal．Screening the protein interacts with C terminal of MIC6of Toxoplasma gondii［J］．Chin J Zoo－noses，2011，27（11）：970－974．（in Chinese）鄭斌，尹志奎，何藹，等．弓形蟲MIC6羧基端相互作用蛋白的篩選［J］．中國人獸共患病學報，2011，27（11）：970－974．

［5］Friedrich N，Santos JM，Liu Y，etal．Members of a novel protein family containing MAR domains act as sialic acid－binding lectins during host cell invasion by apicomplexan parasites［J］．J Biol Chem，2010，285（3）：2064－2076．DOI：10．1074／jbc．M109．060988

［6］Marchant J，Cowper B，Liu Y，etal．Galactose recognition by the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii［J］．J Biol Chem，2012，287（20）：16720－16733．DOI：10．1074／jbc．M111．325928

［7］Jewett TJ，Sibley LD．Aldolase forms a bridge between cell surface adhesins and the actin cytoskeleton in apicomplexan parasites［J］．Mol Cell，2003，11（4）：885－894．DOI：10．1016／S1097－2765（03）00113－8