張智芳，程由注，江典偉，張春梁，林國華，方彥炎，李莉莎，陳寶建

東方次睪吸蟲（Metorchis orientalis）曾一向被人們認為只是危害家鴨等鳥、禽類的寄生蟲。林金祥、程由注首次報告狗、貓自然感染東方次睪吸蟲［1］，這是該蟲感染哺乳類動物的新突破。1998年程由注等在廣東省平遠縣開展棘隙吸蟲調(diào)查研究時，發(fā)現(xiàn)當?shù)氐牡~普遍感染東方次睪吸蟲和華支睪吸蟲，并以前者為優(yōu)勢種群［2］。由于該蟲與華支睪吸蟲的第一、二中間宿主，以及成蟲寄生部位等生物學特征相同或相近，故考慮其對人體感染與致病的可能性，特分離該蟲囊蚴分別做感染狗、貓、雞、鴨以及人體實驗，結果除進一步證實這些實驗動物均能寄生外，并首次證實人體亦能良好感染。進而，調(diào)查當?shù)厝巳汉透黝愃拗鳌０l(fā)現(xiàn)了東方次睪吸蟲人體自然感染病例，并證實當?shù)貫闁|方次睪吸蟲病自然疫源地，該蟲同時存在于華支睪吸蟲病流行區(qū)，往往與華支睪吸蟲混合［3］。人體自然感染東方次睪吸蟲并致病，為21世紀新發(fā)現(xiàn)的人體寄生蟲?。?］。為了解東方次睪吸蟲在終末宿主的動態(tài)發(fā)育過程及致病性過程，特從第二中間宿主麥穗魚體內(nèi)分離得到囊蚴，進行動物感染實驗觀察，結果報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 囊蚴 從福建省浦城縣臨江鎮(zhèn)王村流行區(qū)魚塘捕撈感染有東方次睪吸蟲囊蚴的麥穗魚，取魚肌肉，用壓片法于解剖鏡下查找，鑒定囊蚴，然后分離囊蚴，并將其放在阿爾塞弗氏（Alsever’s）溶液中，暫存于6℃冰箱中備用。

1．1．2 實驗動物 50日齡童雞，感染組雞平均體重394．8g，對照組雞平均體重390．6g。由福州郊區(qū)家禽養(yǎng)殖場提供。實驗前籠養(yǎng)在消毒環(huán)境中，并進行雞瘟苗的免疫接種。

1．1．3 主要試劑及儀器 95%乙醇（分析純）（上海成?；瘜W工業(yè)有限公司），PL602－S型電子天平（上海精宏實驗設備有限公司），HM340石蠟切片機（上海倍曼生物科技有限公司）、C－7070數(shù)碼相機 （OLYMPUS）、顯微鏡（OLYMPUS）和解剖鏡（MOTIC）。

1．2 方法

1．2．1 動物分組及處理 將45只健康童雞，隨機分為9組。設1～8為感染組，以感染后2h、4h、8 h、48h、1周、2周、4周、6周時間分別解剖觀察；第9組為對照組。每組各5只雞，對實驗中途自然死亡者，再作補充感染。將囊蚴置于醫(yī)用膠囊內(nèi)，感染組雞經(jīng)口服吞食感染，2h、4h、8h、48h組每只雞各感染囊蚴100個，1周、2周、4周、6周組每只雞各感染囊蚴200個。各組的飼養(yǎng)條件相同。解剖雞分期處死，取出小腸和肝臟置于生理鹽水中 ，解剖小腸、肝膽管和膽囊，以吸管吸取逸出的東方次睪吸蟲，顯微鏡下查找蟲體，并計數(shù)回收率；在運動減弱或接近死亡時觀察蟲體發(fā)育情況，同時進行測量與拍照。

1．2．2 臨床癥狀與病理變化觀察 感染后每日進行臨床觀察，每隔一周稱體重。定期解剖取蟲，觀察臟器變化。取出的肝臟及膽囊組織用4℃生理鹽水沖洗干凈，在肝臟最大葉距邊緣5mm處取小塊肝組織用4%甲醛固定后，進行常規(guī)石蠟切片、H－E染色，切片觀察病理變化。膽囊組織用4℃生理鹽水沖洗干凈，固定后切片觀察。

1．2．3 數(shù)據(jù)處理 結果用SPSS17．0進行統(tǒng)計學處理，計算平均數(shù)與標準差，用x±s表示，兩組之間率及構成比的比較采用卡方檢驗，均值的比較采用方差分析。

2 結 果

2．1 不同時間實驗感染雞獲蟲情況 所有試驗雞撲殺均查獲蟲體。其中2h、4h、8h、48h的各組蟲回收率較為接近（79．8%～86．2%），經(jīng)統(tǒng)計學處理，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P均﹥0．05）。2h組共檢獲399條蟲中，分別為小腸114條（28．6%）、肝膽管183條（45．8%）、膽囊102條（25．6%）；4h組共檢獲405條蟲，分別為小腸83（20．5%）、肝膽管132（32．6%）、膽囊190（46．9%）；8h組共檢獲418條蟲，分別為肝膽管185（44．2%）和膽囊233（55．8%）；48h組共檢獲431條蟲，分別為肝膽管112（26．2%）和膽囊319（73．8%）；1周組共檢獲637條蟲，分別為肝膽管193（30．3%）和膽囊444（69．7%）。2周組共檢獲394條蟲，分別為肝膽管93（23．6%）%和膽囊301（76．4%）。4周組共檢獲175條蟲，分別為肝膽管23（13．1%）%和膽囊152（86．9%），6周僅于膽囊內(nèi)檢獲蟲。以1周組蟲回收率71．7%最高，隨后回收率呈下降，6周組回收率僅7．6%。不同時間實驗感染雞獲蟲情況見表1。

2．2 各階段蟲體發(fā)育觀察 東方次睪吸蟲后尾蚴在雞體內(nèi)發(fā)育迅速。感染2h時排泄囊內(nèi)淺棕色顆粒消失（圖1），感染4h時排泄囊已與后尾蚴完全不同（圖2）。感染48h時就已出現(xiàn)睪丸等生殖器官雛形（圖3），至感染2周時，只有部分蟲發(fā)育成熟（圖4），但個體發(fā)育不同步，隨后蟲體及口、腹吸盤繼續(xù)發(fā)育增長，至6周時全部蟲發(fā)育才成熟（圖5）。各階段蟲體發(fā)育情況見表1、2。

2．3 感染雞發(fā)病情況

2．3．1 一般情況 部分雞感染第3d開始發(fā)病，第5d普遍發(fā)病并出現(xiàn)死亡。發(fā)病主要特征為不同程度的精神萎靡、食欲減退、活動減弱、常閉目嗜睡和羽毛失去光澤等，隨后癥狀明顯加重。40只感染雞至第6周時先后死亡9只，死亡率達22．5%（均為接種囊蚴200／只）；其中第5d死亡1只，第6d死亡1只，第9d死亡1只，第14d死亡1只，第21d死亡1只，第24d死亡1只，第31d死亡1只，第35d死亡1只，第37d死亡1只；第5～9d雞死亡之前未見明顯征兆，突然倒地，全身抽搐而死；14d以后死亡雞之前2、3d均出現(xiàn)絕食、拉稀便等癥狀，以致衰竭致死。

表1 不同時間實驗感染雞獲蟲與發(fā)育觀察Tab．1 Metorchis orientalis and development observation in experimentally infected chickens at different time

圖1 2h東方次睪吸蟲幼蟲Fig．1 Metorchis orientalis larvae at 2hours p．i．

圖2 4h東方次睪吸蟲幼蟲Fig．2 Metorchis orientalis larvae at 4hours p．i．

圖3 48h東方次睪吸蟲幼蟲Fig．3 Metorchis orientalis larvae at 48hours p．i．

圖4 2周時東方次睪吸蟲蟲發(fā)育接近成熟Fig．4 Metorchis orientalis development approaching maturity at 2weeks

圖5 6周時東方次睪吸蟲成蟲Fig．5 Metorchis orientalis adults at 6weeks

圖6 感染東方次睪吸蟲6周后肝臟與膽囊病變Fig．6 Pathological changes in liver and gallbladder infected with Metorchis orientalis at 6weeks p．i．

表2 實驗雞體內(nèi)不同時間東方次睪吸蟲蟲體和口、腹吸盤大小檢測（單位：μm）Tab．2 Detection on worm body，oral sucker and ventral sucker in experimental chickens in different time for Metorchis orientalis infection

2．3．2 與對照組雞的體重比較 對照組在飼養(yǎng)期間無死亡和未見任何異常表現(xiàn)，從感染前平均體重390．6g，至第6周時上升至844．9g，肝臟呈紅褐色，質(zhì)地柔軟，膽囊橢圓形，大小適中，膽汁呈草綠色或深綠色，肝臟，膽囊寄生蟲檢查全為陰性。感染組雞生長遲緩，增重明顯減慢，平均體重從感染前394．8g至第6周時為523．5g，兩組雞體重差異有統(tǒng)計學意義（t＝2．31＞2．262，P＜0．05）。

2．4 不同時間感染雞肝臟變化

2．4．1 肉眼肝臟變化感染 1周組感染雞有2只輕度腫大。2周后感染雞肝臟普遍有輕度腫大，感染4～6周，肝臟不同程度腫大，為對照組的2～5倍，局部充血紅腫，表面有散在的白色小壞死灶（圖6）。肝臟被膜增厚，肝邊緣囊狀擴張的膽管更加明顯。肝臟質(zhì)地逐漸變硬。切面可見膽管密度增加，管壁增厚變硬，有增生樣白色花紋，個別的膽管呈囊狀擴張，稍加擠壓，膽管內(nèi)蟲體和白色或黃綠色栓塞物溢出切口。

2．4．2 石蠟切片顯微觀察 正常對照組雞肝臟切片顯示肝小葉結構完整，肝細胞排列緊密，大小均勻一致，肝核呈圓形，形態(tài)規(guī)則，肝索排列規(guī)則，無炎癥細胞。見圖7．A。2h和4h病理變化差別不大，肝小葉結構尚完整，實質(zhì)細胞結構基本正常，病變程度較低，在匯管區(qū)可見到淋巴濾泡樣結構，有少量炎癥細胞，中央靜脈周圍有炎性細胞，肝竇和肝細胞之間亦有炎性細胞散在分布，炎性細胞以淋巴細胞為主，見圖7．B。8h肝小葉結構尚完整，肝實質(zhì)細胞病變程度較低，肝內(nèi)血竇及匯管區(qū)靜脈擴張充血，見圖7．C。48h肝小葉結構輕度不完整，肝細胞有水腫，匯管區(qū)大量炎癥細胞浸潤，肝血竇充血明顯 ，見圖7．D。1周組肝小葉周邊細胞排列紊亂，可見肝細胞脂肪變性，胞漿內(nèi)見脂肪空泡，脂肪變的細胞相互連成片狀網(wǎng)眼結構，間質(zhì)小膽管廣泛增生，門管區(qū)尤為明顯，見圖7．E。2周組肝間質(zhì)結締組織明顯增生，肝小葉周圍的肝細胞萎縮，浸潤的炎性細胞以淋巴細胞和嗜酸性粒細胞為主，充滿中央靜脈和彌漫分布在肝竇、肝細胞之間及增生的小膽管周圍、結締組織之間，肝細胞索狀結構消失且排列雜亂，肝血竇縮小，多灶性肝細胞腫脹，呈水樣變性或脂肪變，細胞膜邊界不清，有胞膜溶解現(xiàn)象，部分細胞核固縮、碎裂消失，見圖7．F。4周組病雞肝臟膽小管增生；匯管區(qū)周圍成纖維細胞、結締組織和假膽管增生明顯，并向小葉內(nèi)伸展。中央靜脈淤血，周圍出現(xiàn)膽管上皮樣細胞形成的管套，見圖7．G。6周組肝索排列混亂、膽汁淤積，匯管區(qū)淋巴濾泡增生，肝細胞水腫很嚴重，小膽管增生，大量炎癥細胞（嗜酸性粒細胞，淋巴細胞）浸潤，組織纖維化較嚴重，見圖7．H。

2．5 不同時間感染雞膽囊病理變化

2．5．1 肉眼膽囊變化觀察 感染后1周有3只雞的膽囊腫大，膽囊壁增厚，有出血現(xiàn)象，囊內(nèi)膽汁變少，淡綠色。感染后2周的感染雞膽囊全部腫大（圖8），呈藍灰色或淡綠色，為對照組的2～10倍，膽囊壁增厚明顯，囊內(nèi)容物濃稠狀（圖9）。感染后4～6周，膽囊與感染后2周的腫脹大小相近（圖10），但囊內(nèi)膽汁更為濃稠，或固化為結石狀（圖11）。

2．5．2 石蠟切片顯微觀察 正常對照組，膽囊粘膜排列規(guī)則，結構完整，見圖12．A。2h與4h組差別不大，膽囊粘膜部分上皮細胞脫落，部分區(qū)域出現(xiàn)炎癥反應，見少量炎癥細胞浸潤，病變較輕，見圖12．B。8h膽囊粘膜脫落，炎癥細胞增多，肌層結構完整，見圖12．C。48h粘膜結構不完整，上皮細胞脫落嚴重，粘膜下血管擴張充血、出血明顯，粘膜間質(zhì)水腫，炎癥細胞浸潤，膽囊與周圍組織并無粘連，見圖12．D。1周組膽囊粘膜上皮細胞嚴重脫落，黏膜面變得較為平坦，肌層纖維組織大量增生，見圖12．E。2周組，壞死灶內(nèi)膽管上皮細胞大量增生，呈腺管狀或索狀；擴張膽管內(nèi)可見東方次睪吸蟲，見圖12．F。4周組，膽囊黏膜上皮呈乳頭狀增生，固有膜和黏膜下層大量淋巴細胞浸潤，并有淋巴濾泡形成，見圖12．G。6周組膽囊黏膜下層結締組織增生，并有淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞浸潤，局灶出血，在膽囊與肝臟鄰近處的粘膜下小膽管增生，周圍有淋巴細胞和少量嗜酸性粒細胞浸潤。肌層血管充血、出血，有淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，膽囊壁有散在出血、灶性壞死，小膿腫形成，或全層壞死和壞疽改變見圖12．H。

3 討 論

東方次睪吸蟲在我國分布比較廣泛，在廣東，吉林，福建，四川，江蘇，北京，上海，天津，臺灣等?。ㄊ校┚l(fā)現(xiàn)本蟲感染的宿主。東方次睪吸蟲病不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成損失［5－7］，而且也可感染人體，對人類健康造成影響。東方次睪吸蟲對禽類宿主動物的感染致病早有報道［8－11］，本文通過感染實驗動物雞觀察其動態(tài)發(fā)育以及對宿主致病的過程。顯示感染雞生長緩慢，發(fā)育受阻，死亡率高；感染時間越久，蟲的回收率越低，且膽囊病變越嚴重。當蟲體進入膽管時，成蟲的機械運動可造成膽管上皮機械損傷，感染較重者，大量成蟲可造成膽管的機械性梗阻。另外，活蟲代謝產(chǎn)物、死蟲崩解產(chǎn)物、蟲卵的分泌物均可造成化學性損傷或引起宿主過敏，造成局部的炎癥反應，膽汁淤積，匯管區(qū)淋巴濾泡增生水腫很嚴重，膽管增生，大量炎癥細胞浸潤，嗜酸性粒細胞，淋巴細胞大量增多，組織纖維化較嚴重。當膽囊內(nèi)容物的出路被阻塞時，由于膽囊粘膜仍繼續(xù)分泌粘液，造成膽囊內(nèi)壓力不斷增高使膽囊不斷膨脹、積水，膽囊壁的血管因此受壓而缺血、壞死。當膽囊缺血時，膽囊抵抗力下降，細菌就容易生長繁殖，經(jīng)慢性炎癥，粘膜遭到破壞，呈息肉樣改變，膽囊壁增厚，纖維化、慢性炎細胞浸潤，膽汁持久潴留，膽汁原有的膽色素被吸收，代之以膽囊所分泌的粘液，故引起膽汁顏色、性狀和成份的變化，由于病變時間延長加上炎癥反應，肝臟膽小管擴張嚴重，膽管周圍嗜酸性粒細胞浸潤，纖維組織增生，膽汁在肝臟淤積，引起肝臟損傷，肝臟的炎癥反應越來越嚴重，致使膽囊收縮強烈，又引起膽管內(nèi)炎性感染，膽囊出現(xiàn)嚴重病變，導致絕食、拉稀便等癥狀，以至功能喪失，衰竭死亡。綜上所述，感染雞是由肝膽管阻塞引起的一系列急慢性病變所致，而早期出現(xiàn)的感染雞突發(fā)性死亡，其原因有待進一步研究。

圖7 雞感染東方次睪吸蟲囊蚴后肝臟病理組織學觀察結果Fig．7 Histopathological change in the liver of chicken infected with Metorchis orientalis larvae圖7．A正常雞肝臟Fig．7－A Liver of chicken in normal control group圖7．B感染后2～4h肝細胞結構完整，匯管區(qū)有少量炎癥細胞Fig．7－B Structural integrity in liver cell，and a few inflammatory cells in the portal area at 2－4hours post－infection圖7．C感染后8h肝細胞結構完整，匯管區(qū)炎癥細胞增多，血竇擴張充血Fig．7－C Structural integrity in liver cell，increased inflammatory cell area in the portal area，dilatation and congestion in sinusoids at 8hours p．i．圖7．D感染后48h肝細胞水腫明顯，匯管區(qū)有大量炎癥細胞浸潤，肝內(nèi)血竇及匯管區(qū)靜脈擴張充血Fig．7－D Significant edema in liver cells at 48hours p．i．，consideriable inflammatory cell infiltration in portal area，dilatation and congestion in sinusoids and periportal vein in the liver圖7．E感染后1周肝細胞水腫變性，部分肝實質(zhì)細胞脂肪變性，膽小管廣泛增生，嗜酸性粒細胞浸潤Fig．7－E Hydropic degeneration in liver cell at 1weeks p．i．，fatty degeneration in part of the liver parenchymal cells，extensive hyperplasia in bile canalicular，infiltration of eosinophilia圖7．F感染后2周肝細胞水腫變性，小葉間界限欠清楚，細胞索排列紊亂，膽小管廣泛增生，嗜酸性粒細胞浸潤Fig．7－F Hydropic degeneration in liver cell at 2weeks p．i．，interlobular boundary are unclear，derangement in cell cords，extensive hyperplasia in bile canalicular，infiltration of eosinophilia圖7．G感染后4周肝細胞多灶性壞死，大量炎癥細胞浸潤，肝纖維結締組織明顯增生Fig．7－G Many focal necrosis in liver cells at 4weeks p．i．，considerable inflammatory cell infiltration，obvious proliferation in fibrous connective tissue in liver圖7．H感染后6周肝細胞水腫嚴重，膽管增生，大量炎癥細胞浸潤，嗜酸性粒細胞，淋巴細胞大量增多，組織纖維化Fig．7－H Serious edema in liver cell at 6weeks p．i．，bile duct proliferation，considerable infiltration of inflammatory cells，eosinophilia and lymphocytes increase，tissue fibrosis

圖8 感染2周后肝臟與膽囊Fig．8 Liver and gallbladder at 2weeks post－infection

圖9 感染2周后膽囊內(nèi)容物Fig．9 Gallbladder contents at 2weeks post－infection

圖10 感染4周后肝臟與膽囊Fig．10 Liver and gallbladder at 4weeks post－infection

圖11 感染4周后膽囊內(nèi)容物Fig．11 Gallbladder contents at 4weeks post－infection

圖12 ．A正常膽囊，粘膜規(guī)則Fig．12－A Normal gallbladder and mucosae圖12．B膽囊粘膜部分脫落，可見散在炎癥細胞Fig．12－B Gallbladder mucosa shedding partially and scattered inflammatory cells圖12．C膽囊粘膜脫落，可見炎癥細胞浸潤Fig．12－C Gallbladder mucosa shedding and inflammatory cell infiltration圖12．D膽囊粘膜脫落較嚴重，粘膜結構不完整，大量炎癥細胞浸潤Fig．12－D Gallbladder mucosa shedding seriously，incomplete mucosa structure，and considerable inflammatory cell infiltration圖12．E膽囊粘膜嚴重脫落，但尚有少量殘存，肌層結構尚完整Fig．12－E Gallbladder mucosa shedding seriously with a small amount of remnants，while the muscular structure is intact圖12．F膽囊粘膜完全脫落，結構遭到破壞，肌層有少量炎癥細胞Fig．12－F Gallbladder mucosa shedding completely，the structure is destroyed，and there are a few of inflammatory cell in muscularis圖12．G膽囊粘膜壞死脫落，肌層中等到大量炎癥細胞浸潤Fig．12－G Necrosis and exfoliation in gallbladder mucosa，and the inflammatory cell infiltration in muscularis圖12．H膽囊粘膜壞死脫落，粘膜下血管充血明顯，肌層大量炎癥細胞浸潤Fig．12－H Necrosis and exfoliation in gallbladder mucosa，significant congestion in submucosal vessels，and the muscular layer infiltration is with numerous inflammatory cells

隨著感染時間的延長病變加重，從而使寄生環(huán)境越來越不適應于蟲的生存，致蟲死亡率逐步增多。因此不同階段解剖取蟲，顯示隨著感染時間的延長而蟲的回收率呈下降趨勢。陳誠等對東方次睪吸蟲的囊蚴感染家禽15d左右查及蟲卵［12］。本次研究顯示該蟲后尾蚴侵染宿主后發(fā)育迅速，感染2周后見蟲個體發(fā)育明顯不同步，大多數(shù)尚在繼續(xù)發(fā)育，印證了15d左右檢獲蟲卵只是少部分的蟲發(fā)育成熟蟲體所產(chǎn)的卵。在不同階段觀察蟲體發(fā)育，發(fā)現(xiàn)發(fā)育過程腹吸盤由體中后部逐步移向體前方。早期童蟲呈長橢圓形逐步發(fā)育形成長條形成蟲，蟲體前部結構簡單，而體中后部子宮和體后部的睪丸均發(fā)達，這可能是子宮和睪丸發(fā)育過程向體部擴張，故造成腹吸盤由體中后部逐步向體前方移動的假象。

東方次睪吸蟲的第二中間宿主主要為麥穗魚等多種小型淡水魚類，流行區(qū)常見當?shù)鼐用癫稉菩‰s魚喂雞喂鴨，而不明原因的家養(yǎng)雞鴨死亡，可能是食入含有東方次睪吸蟲囊蚴的小雜魚所致。由于東方次睪吸蟲是魚源性寄生蟲，自然與生態(tài)環(huán)境對本蟲的流行影響極大，切斷了東方次睪吸蟲自然疫源地形成的環(huán)節(jié)，也阻斷了本病的流行與傳播。因此對于東方次睪吸蟲的各個流行環(huán)節(jié)，采取綜合的防治措施。做好健康教育的宣傳工作，不吃未煮熟的池塘魚，對雞，鴨，野雞等糞便進行無害化處理，減少其流入水中，禁止用生魚喂養(yǎng)家禽等，以防制該類寄生蟲病的流行。

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