陳 峰，吳爾翔，丁鎖順，邵亞平，章 杰，唐曉宇

志賀菌是一種常見人獸共患病原菌，在公共衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域十分重視［1－2］。志賀菌屬于常見且重要的腸道致病菌，易引起人類的食物中毒，導(dǎo)致相應(yīng)的消化道癥狀，且易于傳播，因此早期的檢測、治療并控制傳染源有著重要意義［3］。目前臨床針對志賀菌的檢測仍采取細(xì)菌培養(yǎng)鑒定，抗原、抗體的血清免疫學(xué)檢查為主的方式。由于病原微生物的分離、培養(yǎng)、鑒定、分型、標(biāo)記等檢測過程繁瑣，不能滿足臨床的需要。因此建立快速、敏感且特異性高的志賀菌檢測方法非常必要，可有效地預(yù)防該病，控制疾病的傳播［4］。本研究根據(jù)志賀菌的ipaH基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物和探針，應(yīng)用熒光定量PCR法，特異性檢測的志賀菌，以便為進(jìn)一步應(yīng)用于志賀菌快速檢測法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 菌株 福氏志賀菌購于中國菌種保藏中心；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、腸球菌為實(shí)驗(yàn)室分離鑒定后的保存菌株。

1．1．2 實(shí)驗(yàn)材料 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；PCRMix、Taq酶、dNTP、基因組 DNA提取試劑盒購于TaKaRa公司。

1．1．3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的福氏志賀菌M32063株ipaH基因序列，采用Primer軟件設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物F1：5′－GCTCTCCACTGCCGTGAAGG－3′，下游引物 R1：5′－AGTACAGCATGCCATGGTCC－3′，引物序列由上海英駿公司合成。二聚體蝎型探針的上游引物F2、標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)的核苷酸鏈由hexethylene glyco1（HEG）連接如下，5′－FAM－CCGACACGCCATAGAAACGC－HEG－AGCTCTCCACTGCCGT

GAAGG－3′，標(biāo) 記 猝 滅 基 團(tuán) 的 互 補(bǔ) 鏈 為 5′－GCGTTTCTATGGCGTGTCGG－DABCYL－3′， 下游引物 R2：5′－ATAGCTTCGGCAGTGCGGAGG－3′，由生工生物工程（上海）有限公司合成方法。

1．2．1 志賀菌重組標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1．2．1．1 細(xì)菌DNA提取 接種菌落于瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12～16h；刮取1～2接種環(huán)菌苔加入100μL三蒸水中，混勻，100℃煮沸10min；12 000 r／min離心10min，取上清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．1．2 PCR 反應(yīng)體系總體積25μL：10×Buffer：2．5μL；MgCl2：2．0μL；dNTP mix（10mmol／L）：2．0μL；F1（10μmol／L）：1．0μL；R1（10μmol／L）：1．0μL；DNA：5．0μL；Taq DNA 聚合酶：0．5 μL；ddH2O：11μL。反應(yīng)條件：94℃變性10min，30個(gè)循環(huán)（94℃10min，94℃1min，55℃1min，72℃65 s），72℃延伸10min。

1．2．1．3 pMDl8－T－ipaH 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增片段經(jīng)1．5%糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收目的片段，用DNA連接試劑盒16℃過夜連接經(jīng)PCR擴(kuò)增回收的目的片段和質(zhì)粒pMDl8－T，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌H5α后涂在氨芐青霉素（Amp＋）的1．5%瓊脂LB平板。

1．2．1．4 pMDl8－T－ipaH 重組質(zhì)粒的鑒定 挑取少量菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，100℃水浴5 min，立即置于冰上，12 000r／min離心10s，吸取上清行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后，使用1．5%瓊脂糖凝膠電泳。取鑒定后篩選出的陽性克隆重組質(zhì)粒，送至上海英駿公司測序并鑒定。

1．2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將上述各已知濃度的重組質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品分別按10倍梯度稀釋，獲得8個(gè)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為108～101copies／μL，后以每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，濃度的對數(shù)為X軸，相對應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)（threshold cycle，Ct）為 Y 軸，經(jīng)軟件處理得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測體系的建立 在20μL反應(yīng)體系中，加入1μLDNA，二聚體蝎型探針上游引物F22μL，淬滅鏈2μL，下游引物 R22μL，dNTP1．6μL，Mg2＋2μL，10×Buffer2μL，Taq酶0．2μL，ddH2O 7．2μL。預(yù)變性3min，93℃變性反應(yīng)20s，53℃退火延伸15s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，于53℃檢測熒光信號(hào)。

1．2．4 實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

1．2．4．1 敏感性 將質(zhì)粒按l0倍比例稀釋至濃度極限101copies／μL，雙蒸水為陰性對照，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以可區(qū)別陰性對照的最低質(zhì)粒濃度為最低檢測值。

1．2．4．2 特異性 用福氏志賀菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、腸球菌制備模板，用建立的方法進(jìn)行檢測。1．2．4．3 穩(wěn)定性 將不含Taq酶及模板外的全部PCR試劑混合為反應(yīng)液，分別取107～101copies／μL梯度的質(zhì)粒，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將剩余的反應(yīng)液及標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒置于－20℃凍存，每兩天凍融一次，1月后后使用相同試劑再次制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對比兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．4．4 重復(fù)性 批內(nèi)重復(fù)性：一次檢測對一個(gè)濃度臨床樣品重復(fù)做10個(gè)平行管，以Ct值計(jì)算SD和CV。批間重復(fù)性：1天之內(nèi)對一個(gè)濃度臨床樣品重復(fù)檢測10次，以Ct值計(jì)算SD和CV。天間重復(fù)性：檢測一個(gè)濃度臨床樣品，每天測一次，連續(xù)測定10d，記錄結(jié)果并以Ct值計(jì)算SD和CV。

1．2．4．5 臨床糞便標(biāo)本的檢測 將收集臨床可疑糞便樣本15份，取約黃豆大小的可疑糞便于0．5 mL PBS 0．1mmol／L pH 值為7．4，漩渦混勻，取上層至另一離心管中，10 000r／min離心5min，棄上清液，洗滌1次，加入100μL裂解液，漩渦混勻，100℃煮沸10min，10 000r／min離心5min。取上清液進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分離培養(yǎng)組作為對照。1．2．4．6 與TaqMan方法比較 應(yīng)用商品化的志賀菌TaqMan檢測試劑盒（上海科興生物科技有限公司）與建立的二聚體蝎型探針法同時(shí)檢測25份可疑糞便標(biāo)本，檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2．1 志賀菌標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒的構(gòu)建 使用志賀菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到約151bp片段，結(jié)果見圖1。產(chǎn)物純化回收，將目的基因克隆至載體，提取構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測序等工作，證實(shí)擴(kuò)增片段與目的序列相符。

圖1 PCR擴(kuò)增ipaH基因電泳結(jié)果Marker：DNA 標(biāo) 準(zhǔn) 品 （DL－2000）；1：PCR 產(chǎn) 物 （151 bp）Fig．1 PCR amplification of ipaH productsMarker：DNA marker－DL2000；1：PCR products of ipaH （151bp）

2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將制備的志賀菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，采用上述的熒光定量PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行反應(yīng)，重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度調(diào)整與108～101copies／μL時(shí)，可出現(xiàn)理想的擴(kuò)增曲線（圖2）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。

2．3 特異性 利用所建立的方法進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有福氏志賀菌為陽性，其余的均為陰性，證明該方法的特異性好。

2．4 敏感性 將標(biāo)準(zhǔn)品原液作梯度稀釋，分別為108～101copies／μL，進(jìn)行熒光定量 PCR 反應(yīng)（圖4），本法最低可檢測濃度為10copies／μL。

2．5 穩(wěn)定性 試劑經(jīng)反復(fù)凍融后，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：Y＝－3．472 9X＋39．121，相關(guān)系數(shù)為0．9972；與凍融前的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較：Y＝－3．5279X＋39．851，相關(guān)系數(shù)為0．996 7；證實(shí)試劑的穩(wěn)定性較好，反復(fù)凍融對檢測結(jié)果的影響小，結(jié)果分別見圖5、圖6。

圖2 志賀菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR擴(kuò)增曲線從左至右分別為108～101copies／μL 8個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線Fig．2 Amplification curves of the recombinant plasmid From the left to the right：108－101copies／μL of the recombinant plasmid fold dilution respectively．

圖3 志賀菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．3 Standard curve of the recombinant plasmid

圖4 熒光定量PCR的敏感性試驗(yàn)與x軸接近平行的熒光曲線為陰性對照Fig．4 Results of sensitivity test of RT－PCR Fluorescence curve parallel to X axis is the negative control．

圖5 試劑反復(fù)凍融前標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．5 Standard curve before repeated freezing and thawing of reagent

圖6 試劑反復(fù)凍融后標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．6 Standard curve after repeated freezing and thawing of reagent

2．6 重復(fù)性 結(jié)果表明樣品的批內(nèi)重復(fù)性、批間重復(fù)性和天間重復(fù)性CV分別為1．61%、1．93%、2．10%，具有良好的重復(fù)性。

2．7 臨床糞便標(biāo)本的檢測結(jié)果 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和分離培養(yǎng)法分別對15份可疑的糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測，并對比分析，結(jié)果顯示熒光定量PCR法檢測9例為陽性，陽性檢出率為：60% ；分離培養(yǎng)法檢測7例為陽性，陽性檢出率：46．7%?？梢姛晒舛縋CR法于分離培養(yǎng)法均能有效的檢測出糞便標(biāo)本中少量的志賀菌，但熒光定量PCR法僅需要4h，而分離培養(yǎng)法需要3～4d，時(shí)間差異明顯。

2．8 與TaqMan方法比較結(jié)果 應(yīng)用本方法和志賀菌TaqMan檢測試劑盒分別對25份可疑糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測，本法陽性14例，陽性檢出率為：56%；TaqMan定量試劑盒檢測9例陽性，陽性檢出率為36%。Fisher精確概率計(jì)算兩法檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），二聚體蝎型探針法的敏感性高于TaqMan方法。9例標(biāo)本兩法檢測均為陽性，其結(jié)果呈偏態(tài)分布，經(jīng)符號(hào)秩檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

3 討 論

志賀菌屬于無動(dòng)力、無芽孢的G－桿菌，是引起細(xì)菌性痢疾發(fā)病及傳播的主要致病菌，通過受到污染的水源、食物，經(jīng)過糞口途徑傳播，可引起大范圍的爆發(fā)及流行，嚴(yán)重危害公共安全，因此一直受到重點(diǎn)監(jiān)測，一旦出現(xiàn)可疑病例，往往動(dòng)用多方資源，早期的隔離治療［5］。在我國，菌痢被列為法定傳染病，須及時(shí)上報(bào)，危害性僅次于結(jié)核和肝炎，在感染性腹瀉的發(fā)病比例中居首位。志賀菌屬可分為痢疾志賀菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌四個(gè)群屬，分別簡標(biāo)為 A、B、C、D［6－7］。近年來通過分子生物學(xué)的相關(guān)手段檢測志賀菌的臨床應(yīng)用已普遍開展，且有逐漸取代常規(guī)的生物培養(yǎng)鑒定、抗原與抗體檢測的趨勢，準(zhǔn)確性較高，對于疾病的早期診斷、治療、患者隔離有重要的意義。因此通過分子生物學(xué)方法建立敏感、特異的志賀菌檢測方法是當(dāng)務(wù)之急［8］。

所有產(chǎn)毒的志賀菌中都有侵襲性大質(zhì)粒，大小約220kb。侵襲性質(zhì)粒抗原基因（ipaH）同時(shí)存在于染色體和侵襲性大質(zhì)粒上，而且是多拷貝分散存在（4～10個(gè)），因而從ipaH設(shè)計(jì)引物建立PCR方法應(yīng)該有較高的敏感性，并可避免因基因突變、質(zhì)粒丟失而導(dǎo)致的假陰性。因此ipaH通常作為志賀菌屬的鑒定基因［9－10］。

熒光定量PCR廣泛的應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究及臨床應(yīng)用中，但由于現(xiàn)有的Taqman探針存在較難純化、標(biāo)記的缺陷，且該檢測對Taqman自身的要求高，反應(yīng)時(shí)間長，較難滿足要求［11－12］。因此通過二聚體蝎形熒光探針技術(shù)進(jìn)行定量檢測，有更好的可操作性及準(zhǔn)確性。應(yīng)用蝎形熒光探針進(jìn)行檢測無特異性產(chǎn)物時(shí)，淬滅鏈與報(bào)告鏈雜交，檢測不到熒光；當(dāng)有特異產(chǎn)物時(shí)，分子內(nèi)部的雜交比分子間容易，因此報(bào)告鏈更易與產(chǎn)物連雜交，可檢測到熒光［13］。因?yàn)檎麄€(gè)雜交反應(yīng)過程是單個(gè)分子內(nèi)部的作用，背景的干擾低，熒光信號(hào)易于檢測，且檢測靈敏度高，便于臨床的開展及應(yīng)用［14］。

可疑糞便標(biāo)本檢測結(jié)果顯示，本方法靈敏度明顯高于利用Taqman技術(shù)建立的方法，這是由于此種探針的熒光強(qiáng)度高于TaqMan探針。這種探針具有快循環(huán)的特點(diǎn)，我們自行設(shè)計(jì)探針擴(kuò)增出的片段長82bp，擴(kuò)增條件：93℃3min、93℃20s、53℃15 s，并采集熒光信號(hào)，經(jīng)40個(gè)循環(huán)左右約70min即可得到結(jié)果，所需時(shí)間較Taqman探針（2h左右）明顯縮短。這種探針設(shè)計(jì)簡單，不需要專門軟件，合成成本較低，所需的條件和技術(shù)水平較低，即使一般的實(shí)驗(yàn)室也比較容易開展。

與傳統(tǒng)的志賀菌定量檢測不同，本研究根據(jù)志賀菌中特異的ipaH基因?yàn)槟康钠?，成功的?gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入志賀菌屬，制備了可供大量使用的標(biāo)準(zhǔn)品。后應(yīng)用二聚體蝎形熒光探針技術(shù)，通過熒光定量PCR法檢測志賀菌，以期為志賀菌的快速檢測奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。通過建立二聚體蝎形探針熒光定量PCR法，檢測志賀菌，結(jié)果證實(shí)該檢測法快速靈敏，特異性高，穩(wěn)定性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到了預(yù)期效果，可滿足對于志賀菌的早期篩查、確診需要，今后可在傳染病監(jiān)測等工作方面開展應(yīng)用。

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