張秀靜，趙海濱，王帥，郭夢(mèng)，許曉英，馬迪

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后的心肌重塑與心臟破裂、室壁瘤形成及心力衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥密切相關(guān)，在AMI死亡及預(yù)后中起至關(guān)重要的作用[1]。AMI后心肌重塑機(jī)制復(fù)雜，后果嚴(yán)重，療效不理想，相關(guān)研究亟待深入。張海嘯等實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)/Smads信號(hào)通路的過(guò)度激活在誘發(fā)并加重AMI后心肌重塑病理過(guò)程中居關(guān)鍵地位[2]。但目前對(duì)其活化調(diào)控缺乏有效手段。祛瘀生新法以中醫(yī)“祛瘀血、生新血”為理論基礎(chǔ)，對(duì)AMI后心肌重塑療效肯定。本課題組通過(guò)研究祛瘀生新法在大鼠AMI后心肌重塑中的干預(yù)作用及對(duì)TGF-β1/Smads通路和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)動(dòng)員的影響，探討祛瘀生新法對(duì)AMI后心肌重塑的效應(yīng)機(jī)制，為祛瘀生新藥治療AMI后心肌重塑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

成年清潔級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體重(250±10)g，合格證編號(hào)：0240574，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

血塞通軟膠囊：生產(chǎn)批號(hào)為Z20040016，由昆明圣火制藥有限責(zé)任公司提供；總RNA試劑提取盒：由康為世紀(jì)提供；5×SYBR Green PCR Master Mix：AB Applied Biosystems公司；dNTP：Solarbio公司；OligodT、Rnasin、M-MLV：PROMEGA公司；引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，PE標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞抗原1抗體及干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(c-kit)均由北京博奧森生物科技有限公司提供；M×3000P熒光定量PCR儀：Agilent Technologies Stratagene。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型 用隨機(jī)數(shù)字表法將50只大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型組、中藥組、西藥組，每組10只，分籠飼養(yǎng)。

模型組：參照文獻(xiàn)[3-4]制備AMI大鼠模型。鹽酸戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉。經(jīng)口氣管插管行小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，有氧正壓通氣，潮氣量5~6 ml，吸呼比1∶2，呼吸頻率80/min。連接標(biāo)準(zhǔn)12導(dǎo)聯(lián)，記錄大鼠心電圖。經(jīng)左前胸廓旁第3、4肋間逐層開(kāi)胸，暴露心臟，分離心包，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳交界處用5-0號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)近端制成AMI模型，以心電圖出現(xiàn)壞死性Q波判斷為可能AMI，若無(wú)病理性Q波，則再次結(jié)扎，以提高AMI模型成功率，然后逐層縫合心腔。術(shù)后常規(guī)抗感染治療。

中藥組：制備AMI大鼠模型，術(shù)后立即給血塞通軟膠囊治療，給藥量按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》所示劑量換算法計(jì)算[5]：200 g大鼠計(jì)量(g/kg)=人的劑量(1 g/kg?d)×0.018。每天灌胃1次，共用7 d。

西藥組：制備AMI大鼠模型，第6天腹腔注射基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1受體阻斷劑AMD3100，5 mg/kg，余同模型組大鼠。

假手術(shù)組：大鼠經(jīng)歷上述手術(shù)過(guò)程，絲線從冠狀動(dòng)脈下穿過(guò)但不結(jié)扎。

正常組：不做造模處理。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組心肌組織TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA表達(dá)

1.2.2.1 心肌組織總RNA的提取 心腔內(nèi)注射10%氯化鉀使心臟停跳于舒張期，迅速取下心臟，去除心房大血管及心臟外結(jié)締組織，沖洗干凈，分別置于液氮中保存。左室用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。在冰塊上切取50~100 mg的心肌組織塊，采用試劑盒提取組織的總RNA，操作按說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2.2 cDNA的合成 RNA樣品取10 μg，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μl，無(wú)RNase(Ribonuclease)水補(bǔ)足至總體積25 μl。反應(yīng)條件：42 ℃ 1 h；95 ℃15 min，4 ℃10 min。得反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription,RT)終溶液即為cDNA溶液。

1.2.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 每種組織均以TGF-β1mRNA和β-actin基因引物進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，每管設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在96孔PCR板中進(jìn)行。TGF-β1引物序列：上游引物5'-GTG TGG AGC AAC ATG TGG AAC TCT-3'，下游引物5'-TTG GTT CAG CCA CTG CCG TAC CGC-3'，產(chǎn)物143 bp。Smad3上游引物5'-GTC AAC AAG TGG TGG CGT GTG-3'，下游引物5'-GCA GCA AAG GCT TCT GGG ATA-3'， 產(chǎn)物 150 bp。Smad7上游引物5'-GGA GTC CTT TCC TCT CTC-3'，下游引物5'-GGC TCAATG AGC ATG CTT-3'，產(chǎn)物 125 bp。內(nèi)參β-actin：上游引物5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TAG-3'，下游引物5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3'，產(chǎn)物150 bp。反應(yīng)條件：95℃，10 s；95℃，30 s；55℃，30 s。共40個(gè)循環(huán)。每例樣本反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算并讀出定量結(jié)果Ct值。Ct值采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.3 病理形態(tài)學(xué)檢查 各組處死大鼠，取心肌組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片HE染色，在光鏡下進(jìn)行病理觀察。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，肝素抗凝。Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，稀釋至1×106/ml，分別加入熒光素藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞抗原1(CD117)抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 免疫組化檢測(cè) 采用SP法，DAB顯色，在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)c-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，每張切片隨機(jī)取9個(gè)視野，取其均值作為測(cè)定值，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。所得數(shù)據(jù)均用(±s)表示，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織病理學(xué)觀察

正常組及假手術(shù)組整體均呈現(xiàn)正常心肌膜組織。模型組：心肌細(xì)胞數(shù)量較少且散在，結(jié)締組織整片廣布，炎性細(xì)胞聚集，成纖維細(xì)胞多，整體呈現(xiàn)AMI(重癥)心肌膜組織。中藥組：心肌細(xì)胞間有大量炎性細(xì)胞聚集，整體呈現(xiàn)心肌炎心肌膜組織。西藥組：結(jié)締組織整片占據(jù)切片較大區(qū)域，炎性細(xì)胞散在，淺粉紅色膠原成分較多，紅細(xì)胞聚集且多，整體呈現(xiàn)AMI(輕癥)心肌膜組織。見(jiàn)圖1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，中藥組與西藥組均明顯高于模型組(P<0.01)，中藥組與西藥組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 免疫組化檢測(cè)

模型組單位面積內(nèi)c-kit標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于假手術(shù)組(P<0.05)，中藥組與西藥組均高于模型組(P<0.05)，中藥組與西藥組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

表1 各組外周血PE標(biāo)記CD117細(xì)胞數(shù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

表2 各組免疫組化c-kit標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

圖2 各組c-kit免疫組化染色(光學(xué)顯微鏡，400×)

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

模型組與假手術(shù)組相比，TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表達(dá)均明顯增加(P<0.01)，Smad7 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。中藥組和西藥組較模型組TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，而Smad7 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。中藥組與西藥組比較，均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組心肌組織TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果

3 討論

AMI后心肌重塑是指由于心肌嚴(yán)重缺血、壞死所導(dǎo)致的一系列心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型的變化，主要包括[6]：①病理性心肌細(xì)胞肥大伴胚胎性基因再表達(dá)；②心肌細(xì)胞的凋亡與壞死；③細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積或降解增加。其分子和細(xì)胞機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。多數(shù)研究認(rèn)為信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與的神經(jīng)內(nèi)分泌-細(xì)胞因子系統(tǒng)是引起心肌重塑的關(guān)鍵因素[7]。

近年來(lái)，大量研究表明，在心肌損傷修復(fù)過(guò)程中，血管緊張素Ⅱ(angiotninⅡ，AngⅡ)、β腎上腺素、內(nèi)皮素等引起心肌纖維化、心肌重塑均可導(dǎo)致TGF-β1增加、TGF-β1/Smads信號(hào)通路過(guò)度激活，這成了諸多因素所致心肌重塑的共同通路[8]。因而，TGF-β1/Smads通路激活在AMI后的心肌重塑過(guò)程中起重要作用。最近研究表明[9-10]，BMSCs“歸巢”在AMI后心肌重塑保護(hù)效應(yīng)中療效確切，因而也應(yīng)是較佳的治療靶點(diǎn)，然而正常情況下外周血中干細(xì)胞含量很低，達(dá)不到修復(fù)壞死心肌所需的濃度。因此，西醫(yī)學(xué)治療AMI后心肌重塑，主要使用粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocytecolony stimulating factor,G-CSF)、AMD3100、粒巨細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophag colony-stimulating factor,GM-CSF)等作為AMI后干細(xì)胞“歸巢”的有效動(dòng)員劑，相關(guān)研究表明治療AMI后心肌受損的有效性確切[11-12]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)心肌梗死后，外周血及梗死心肌區(qū)BMSCs明顯增多，ADM3100對(duì)干細(xì)胞循環(huán)有動(dòng)員效應(yīng)。

AMI屬中醫(yī)“胸痹、真心痛”的范疇，是血道閉塞、血脈不通、瘀血滯塞脈絡(luò)所致，以“血?dú)獠恢痢?、“血凝而不流”、“血瘀滯不行”等為主要病理機(jī)制，以胸悶胸痛、心悸氣短等為主要癥狀?！办铕錾隆币喾Q化舊生新、除舊生新，方而通過(guò)祛瘀、化舊或去腐等方法來(lái)祛除體內(nèi)沉積的瘀血及其他陳舊性的病理產(chǎn)物，另一方面而強(qiáng)調(diào)應(yīng)用生新方法來(lái)召它血、生新血、生新絡(luò)、生新物，“祛瘀”與“生新”相輔相成，不可偏廢[13]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)祛瘀生新法對(duì)大鼠AMI后心肌重塑的作用及對(duì)TGF-β1/Smads通路的干預(yù)后，經(jīng)流式細(xì)胞儀及免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中藥組較模型組BMSCs均明顯增多，說(shuō)明祛瘀生新法對(duì)其有動(dòng)員效應(yīng)，也是“生新血”的具體體現(xiàn)；TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表達(dá)有所降低(P<0.05)。分子生物學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)中藥組較模型組Smad7 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，心肌組織損傷也有所減輕，TGF-β1/Smads通路作為關(guān)鍵調(diào)控因子參與AMI后的心肌重塑過(guò)程，祛瘀生新中藥對(duì)TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，同時(shí)增加Smad7 mRNA的表達(dá)，從而有效改善AMI后的心肌重塑，這可能是祛瘀生新法能抑制心肌梗死后心肌重塑的重要機(jī)制之一。至于祛瘀生新法是否還有其他的活化調(diào)控機(jī)制，還有待進(jìn)一步深入研究。

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