楊 帆 李東風 徐書雯 (南方醫(yī)科大學研究生院，廣東 廣州 50080)

β淀粉樣蛋白(Aβ)毒性學說是阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的主流學說〔1，2〕。大量的Aβ沉積形成老年斑是AD最具特征性的病理改變〔3〕。已知在 AD老年斑周圍聚集活化的小膠質(zhì)細胞，Aβ可促進小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)等炎癥因子〔4，5〕，從而對神經(jīng)元在內(nèi)的各種細胞造成損傷甚至凋亡。Aβ以寡聚體或纖維體兩種狀態(tài)存在，這兩種狀態(tài)的Aβ對神經(jīng)細胞功能損傷的強度不同〔6〕。一般認為，Aβ寡聚體的毒性較纖維體更強，因此，近年來關(guān)于AD發(fā)病機制的研究一般以寡聚體刺激造模為主。但由于寡聚體的穩(wěn)定性較差，易向纖維體轉(zhuǎn)化〔7〕，體外研究操作時間窗相對較短，所以使用寡聚體進行實驗之前，對其進行鑒定就顯得尤為重要，但目前關(guān)于Aβ聚集狀態(tài)的鑒定方法報道較少。為此，本實驗先制備不同聚集狀態(tài)的 Aβ1～42，然后鑒定兩種 Aβ1～42形態(tài)，進一步證實Aβ1～42聚集形態(tài)與神經(jīng)毒性作用的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠小膠質(zhì)細胞株(BV2)購自武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，Aβ1～42購自ENZO公司，腫囊收縮素-8(CCK-8)試劑盒購自日本同仁公司，原子力顯微鏡(AFM，本原納米儀器公司，型號CSPM5500)。

1.2 方法

1.2.1 BV-2細胞培養(yǎng) 將BV-2細胞株接種到含10%胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每3 d傳代一次，用0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化。

1.2.2 Aβ1～42寡聚體和纖維體的制備 將1 mg Aβ1～42粉末溶于冷卻的六氟異丙醇(HFIP)220 μl中，室溫孵育60 min使Aβ1～42充分溶解，將Aβ肽-HFIP放置在冰上5～10 min后移至通風櫥內(nèi)，打開瓶蓋以便HFIP揮發(fā)。風干后形成透明的Aβ肽膜，溶解于44 μl新鮮無水100%二甲基亞礬(DMSO)，制成5 mmol/L Aβ1～42合成肽。

(1)寡聚體制備:用無含酚紅的F12培養(yǎng)液將5 mmol/L Aβ1～42合成肽稀釋成終濃度 50 nmol/L，4℃ 孵育 24 h 后，以4℃、14 000 r/min 離心 10 min，取上清液即為 Aβ1～42寡聚體，置于-80°C冰箱保存。

(2)纖維體制備:將 5 mmol/L Aβ1～42合成肽溶于10 mmol/L HCl，并稀釋成終濃度50 nmol/L，然后放置在37℃溫箱孵育24 h即為纖維體，置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 AFM鑒定 將Aβ1～42寡聚體和纖維體制成品分別滴于新鮮解離的云母片上，室溫下靜置5 min后用去離子水輕柔沖洗，干燥皿中干燥10 min。將制備好的 Aβ1～42樣品在 AFM下觀察，先用接觸模式掃描到云母片上的生物制品，再改用輕敲模式進行掃描。輕敲模式參數(shù):力常數(shù)40 N/m，共振頻率300 kHz，掃描頻率1 Hz。圖像處理軟件為Imager 4.60。

1.2.4 CCK-8細胞存活率測定 在96孔板上以每孔10 000個小膠質(zhì)細胞種板，加入無血清DMEM/F12高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度Aβ1～42寡聚體和纖維體，共同作用24 h后吸除上清液，每孔加入180 μl培養(yǎng)基L+20 μl CCK-8試劑避光共同孵育，待2 h后通過酶標儀測定450 nm OD值。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結(jié)果以±s表示，采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 BV-2小膠質(zhì)細胞形態(tài) 細胞呈兩種形態(tài):一種為圓形或橢圓形、折光性強的小細胞，是處于一定活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞;另一種呈不規(guī)則胞體，且有細長突起，是處于靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞。見圖1。

2.2 AFM鑒定Aβ1～42的不同聚集狀態(tài) AFM下不同聚集狀態(tài)Aβ1～42的形態(tài)有差別。Aβ1～42寡聚體呈球狀或橢圓球狀顆粒，高度為5 nm左右;而Aβ1～42纖維體在鏡下呈現(xiàn)長條纖維狀聚集，高度約為3 nm左右，長度＞1 000 nm。見圖2。

圖1 BV-2細胞形態(tài)(×400)

圖2 AFM鑒定Aβ1～42的聚集狀態(tài)

2.3 CCK-8法比較不同聚集狀態(tài)Aβ1～42對BV-2細胞存活率的影響 無論纖維體還是寡聚體，Aβ1～42對BV-2細胞均有損傷作用，并且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。同時，在同樣濃度水平的條件下，自0.1 μmol/L濃度起，寡聚體的毒性作用均比纖維體更顯著(P＜0.05)。見圖3。

圖3 不同聚集狀態(tài)Aβ1～42對BV-2細胞存活率的影響

3 討論

AD的發(fā)病機制迄今未完全清楚，而Aβ毒性學說最受關(guān)注。Aβ是由淀粉樣前體蛋白水解所產(chǎn)生的多肽，有兩種主要存在形式:Aβ1-40和Aβ1～42，共存于老年斑中。在正常情況下，Aβ的產(chǎn)生和降解過程保存平衡，但在AD患者腦中，這種平衡狀態(tài)受到破壞，導致 Aβ的異常聚集沉積形成老年斑〔8〕。Aβ1～42毒性較Aβ1-40強，更易發(fā)生聚集沉積形成老年斑。

研究發(fā)現(xiàn) Aβ1～42的聚集狀態(tài)與其神經(jīng)毒性關(guān)系密切，Aβ1～42形成可溶性寡聚體時的神經(jīng)毒性強于其他不可溶性Aβ物質(zhì)〔9〕。

AFM是一種可用來研究固體材料表面結(jié)構(gòu)的顯微鏡，其橫向分辨率為23 nm，縱向分辨率為0.5 nm。AFM通過檢測待測樣品表面和一個微型力敏感元件(探針)之間的極微弱的原子間相互作用力來研究物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，可以納米級分辨率獲得直觀的物體表面結(jié)構(gòu)信息。AFM已成為研究生物醫(yī)學樣品和生物大分子的重要工具之一。近年來，AFM越來越多地被應(yīng)用于核酸、多肽、蛋白質(zhì)、微生物和細胞等方面研究。目前常用于鑒定Aβ1～42聚集狀態(tài)的方法包括有硫磺素T(ThT)熒光光譜分析、電子顯微鏡等〔10〕。AFM在分辨率方面較電子顯微鏡更具優(yōu)勢，原子力分辨率最高達到原子級0.1 nm，而掃描電子顯微鏡達到6～10 nm，且AFM成像可得到三維立體的圖像，其樣本制作要求比較簡單，對環(huán)境要求也低。AFM可以在自然狀態(tài)(空氣或者液體)下對生物醫(yī)學樣品直接進行成像。基于AFM的顯著優(yōu)點，本研究嘗試應(yīng)用該手段對Aβ1～42的聚集狀態(tài)進行鑒定。

AFM的掃描模式可分為非接觸模式、接觸模式和輕敲模式，因 Aβ1～42為非常柔嫩、易變形的樣品，故在本研究中，工作模式先選用接觸模式在云母片上掃描到樣品后再改用輕敲模式周期性地短暫地接觸樣品表面進行成像掃描，將對Aβ1～42形態(tài)改變的影響降至最小，最大程度呈現(xiàn)Aβ1～42的表面結(jié)構(gòu)。在制備Aβ1～42聚集狀態(tài)的過程中觀察到:Aβ1～42單體溶于 DMSO后，先形成合成肽，經(jīng)過4℃孵育24 h后形成寡聚體，但隨著孵育時間延長至超過48 h后，寡聚體狀態(tài)漸聚集成纖維體狀態(tài)，寡聚體在常溫狀態(tài)不穩(wěn)定，需放置于-80℃保存。因為BV-2細胞表面有其他蛋白物質(zhì)存在，所以AFM無法在BV-2細胞表面直接觀察到Aβ的狀態(tài)。

Aβ1～42的神經(jīng)毒性作用非常復(fù)雜，可通過多條途徑對神經(jīng)細胞造成不同程度及不同類型的損害，例如可通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、干擾膽堿能系統(tǒng)等作用促進神經(jīng)細胞的凋亡，造成記憶、認知功能的損害。本實驗證實Aβ1～42寡聚體比纖維體更具細胞毒性，與先前報道一致〔11，12〕。然而，本實驗所證實的Aβ細胞毒性作用是基于體外研究結(jié)果，其在AD顱腦內(nèi)對小膠質(zhì)細胞的實際作用過程是否完全一致，尚有待進一步研究。

總之，Aβ1～42寡聚體以及纖維體兩種不同聚集形態(tài)對神經(jīng)細胞的毒性作用具有顯著差異。本研究介紹的AFM鑒定則為此提供了一種簡單、直觀又準確的手段。

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