吳冬寒，張學(xué)娟，吳冬冰

（海南省三亞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 572000）

有研究報道明抑癌基因p53和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)［1］。作者為探討抑癌基因p53和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在胃癌和癌前病變中的表達(dá)情況，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測p53和PCNA在正常胃黏膜→腸上皮化生→異型增生→胃癌的演變過程的表達(dá)，探討p53和PCNA與胃癌發(fā)生、發(fā)展及其與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2009年1月至2010年12月收集的胃組織148例，術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實(shí)，術(shù)后病理其中腸上皮化生26例，中、重度不典型增生28例，原發(fā)性胃癌69例，正常胃黏膜組織25例設(shè)為正常對照組。69例原發(fā)性胃癌中，男性54例，女性15例；年齡33～78歲，平均（52.0±16.13）歲；術(shù)前均未經(jīng)化療和放療。按世界衛(wèi)生組織制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織分型，高、中分化腺癌39例，低及未分化分化腺癌22例，黏液腺癌6例，印戒細(xì)胞癌2例。病理分期［國際抗癌聯(lián)盟（UCIC）標(biāo)準(zhǔn)］為1期11例，2期22例，3期27例，4期9例。浸潤深度：漿膜內(nèi)（包括黏膜層、黏膜下層、肌層）16例，漿膜層和漿膜外層53例；腫瘤直徑大于或等于5cm者24例，小于5 cm者45例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無轉(zhuǎn)移者27例。

1.2 試劑 SP試劑盒試、鼠抗p53單克隆抗體、鼠抗PCNA單克隆抗體由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供。

1.3 方法 組織玻片經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理，石蠟標(biāo)本4μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，逐級乙醇水化，免疫組織化學(xué)SP法按試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色。以已知陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液（PBS）替代一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 p53和PCNA表達(dá)陽性細(xì)胞胞核呈明顯棕黃色著色。p53高倍鏡下每張切片隨機(jī)選擇10個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，依據(jù)細(xì)胞染色程度、及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評分［1］：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；0分為無陽性細(xì)胞，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比乘積大于3分為陽性。PCNA計數(shù)用PCNA標(biāo)記指數(shù)（PCNALI），每個標(biāo)本隨機(jī)觀察5個高倍視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 本組資料采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理，組間進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p53、PCNA在正常胃組織和病變組織中的表達(dá) p53在正常胃黏膜和腸化上皮組織中無陽性表達(dá)，胃癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于異型增生組織，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。從正常胃黏膜、腸上皮化生、異型增生到胃癌，PCNA標(biāo)記指數(shù)（PCNALI）逐漸遞增，PCNA在腸化、不典型增生和胃癌中陽性表達(dá)率與正常胃黏膜比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且呈遞增趨勢（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 p53和PCNA在正常胃黏膜及病變組織中的表達(dá)

圖1 胃癌組織中p53、PCNA表達(dá)均呈細(xì)胞核陽性（SP×200）

2.2 胃癌組織中p53、PCNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

p53、PCNA表達(dá)與胃癌的分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，分化程序越低、有淋巴轉(zhuǎn)移，p53、PCNA陽性表達(dá)越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 胃癌中p53表達(dá)與PCNALI的關(guān)系 p53陽性表達(dá)組的PCNALI（65.69±17.48）明顯高于p53陰性表達(dá)組PCNALI（25.03±8.97），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 p53和PCNA的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

大量的研究表明胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多階段逐步演變過程，胃癌的演變遵循正常胃黏膜→腸上皮化生→異型增生→胃癌的變化規(guī)律，其間涉及多種癌基因和抑癌基因的表達(dá)和調(diào)控［2］。抑癌基因p53對細(xì)胞周期的增殖具有負(fù)調(diào)控作用，它可使細(xì)胞停滯于G1期，抑制DNA合成及誘導(dǎo)DNA修復(fù)，從而抑制細(xì)胞的增殖［3－5］。p53另外一個主要的靶基因是 Mdm2，編碼泛素連接酶，Mdm2可以結(jié)合p53蛋白的N端引起p53的失活，出核轉(zhuǎn)運(yùn)、降解［6］。p53也是一種細(xì)胞老化的主要調(diào)節(jié)器，能封閉細(xì)胞周期有利于細(xì)胞進(jìn)入老化［7］。突變是腫瘤抑制基因失活的主要機(jī)制之一，p53與50%的人類癌癥有關(guān)，在胃癌中p53的突變頻率達(dá)到32%［8］?；蛲蛔兒髉53就失去了上述作用。在p53基因編碼的蛋白中，野生型p5蛋白的半衰期很短，而突變型p53蛋白降解緩解，代謝半衰期較長，積聚在核內(nèi)易于檢測到，所以使用免疫組化檢測的p53均為突變型。本研究發(fā)現(xiàn)突變型p53蛋白在正常胃黏膜、腸化上皮無表達(dá)，在異型增生中有低表達(dá)，且主要是在重度不典型增生中出現(xiàn)，而在胃癌中的表達(dá)明顯增高，提示p53蛋白的異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，突變后p53基因抑制細(xì)胞增殖能力減弱，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控從而發(fā)生腫瘤。此外p53蛋白的檢測有助于對胃黏膜癌變傾向的判斷和胃癌的早期診斷。Forones等采用免疫組化的方法分別檢查了胃腺癌、慢性胃炎和腸化生胃黏膜組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯示胃腺癌中p53的陽性表達(dá)高達(dá)59%，結(jié)果也與本例相符［9］。本研究結(jié)果顯示p53蛋白的異常表達(dá)與胃癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，低、未分化胃癌p53蛋白表達(dá)明顯高于高、中分化胃癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組p53蛋白表達(dá)也明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，與文獻(xiàn)報道相符［10－12］。提示p53蛋白的異常表達(dá)與胃癌生物學(xué)行為密切相關(guān)，p53可作為評價胃癌惡性程度和擴(kuò)散的重要指標(biāo)。

PCNA是一種核蛋白，在DNA合成中起重要作用，能與DNA多聚酶δ結(jié)合，參與DNA復(fù)制。PCNA的表達(dá)和細(xì)胞增殖周期相關(guān)，它在G1后期開始升高，G1／S期交界時達(dá)到高峰，G2、M期明顯下降，檢測PCNA可客觀反映細(xì)胞增殖活性［13］。PCNA陽性細(xì)胞的多少與腫瘤發(fā)展、預(yù)后均有密切的關(guān)系［14］。在腫瘤的發(fā)生過程中，細(xì)胞增生活躍，處于增生狀態(tài)，其PCNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，且隨著疾病的發(fā)展，PCNA表達(dá)也逐漸增加［15］。本研究顯示，在正常胃黏膜→腸上皮化生→不典型增生→胃癌的演變過程中PCNALI呈遞增趨勢，說明在胃癌變過程，隨著病變的加重，惡性程度的增高，細(xì)胞的增殖活性逐漸增強(qiáng)。結(jié)果顯示胃癌的形成與胃黏膜上皮過度增殖有關(guān)。本研究還顯示PCNA的表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，分化程度越低、有淋巴轉(zhuǎn)移，p53、PCNA陽性表達(dá)越高，提示胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞不斷增殖的結(jié)果，腫瘤細(xì)胞的增殖活性與胃癌的生物學(xué)行為，特別是腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等密切相關(guān)。檢測PCNA對胃癌的分化、侵襲和預(yù)后判斷有重要的意義。

本研究結(jié)果表明，p53蛋白陽性表達(dá)組的PCNALI明顯高于陰性表達(dá)組，表明p53基因的突變可使細(xì)胞過度增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的形成和發(fā)展。PCNA的表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等密不可分。聯(lián)合檢測p53和PCNA對判斷胃癌的發(fā)展和預(yù)后及指導(dǎo)治療有積極意義。

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