王傲雪，李 微，陳秀玲，李景富

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄真菌性病害已成為影響番茄生產(chǎn)的主要病害，嚴(yán)重影響番茄品質(zhì)和產(chǎn)量[1]。哈茨木霉（Trichnderma harzianum）是一種廣泛應(yīng)用于植物真菌病害防治的重寄生真菌[2]，能夠通過(guò)拮抗作用防治番茄灰霉病[3]。哈茨木霉菌株產(chǎn)生的包括幾丁質(zhì)酶在內(nèi)的細(xì)胞壁降解酶[4]，在抑菌中起重要作用。在植物病害防治中，幾丁質(zhì)酶在有效防治植物病原真菌的同時(shí)，還可以刺激植物分泌幾丁質(zhì)酶，從而增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抵抗力，因而在生物防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。

Error-prone PCR原理是利用DNA聚合酶不具備3'→5'校對(duì)性質(zhì)，在PCR過(guò)程中出現(xiàn)堿基錯(cuò)配從而進(jìn)行特定基因隨機(jī)誘變的技術(shù)。此方法可獲得改善活性和穩(wěn)定性的突變產(chǎn)物，因此易錯(cuò)PCR以其操作簡(jiǎn)便、有效等優(yōu)點(diǎn)成為目前應(yīng)用最為廣泛的進(jìn)化手段之一[5-6]。Nakaniwa等運(yùn)用Errorprone PCR方法對(duì)一種耐熱性果膠酸裂解酶（PL47）進(jìn)行體外定向進(jìn)化，得到3個(gè)低耐熱的突變株，突變株在耐熱性和耐熱活力上均低于PL47[7]。Deng等運(yùn)用Error-prone PCR方法對(duì)Escherichia coli氨基葡萄糖合成酶（GlmS）進(jìn)行改良，得到10個(gè)突變株，其中一個(gè)突變株蛋白酶的活性為野生型的2倍[8]。Niu等通過(guò)DNA shuffling和易錯(cuò)PCR的方法對(duì)根霉菌脂肪酶進(jìn)行定向改造，從而得到熱穩(wěn)定性提高的突變株，并證明對(duì)酶熱穩(wěn)定性和最適作用溫度起決定性作用的位于190位點(diǎn)[9]。

本試驗(yàn)通過(guò)調(diào)整Error-prone PCR的試驗(yàn)條件：提高M(jìn)g2+濃度，加入Mn2+，調(diào)整dNTP比例等因素，得到使哈茨木霉幾丁質(zhì)酶基因產(chǎn)生突變的的試驗(yàn)條件，為后期對(duì)哈茨木霉幾丁質(zhì)酶進(jìn)行體外定向進(jìn)化，獲得酶活大幅提高的突變酶奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所保存。

1.1.2 供試藥劑

RNA提取試劑Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶、MgCl2、PCR Buffer購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；dNTPs購(gòu)自ToYoBo公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Fermentas公司；DNA Marker、pMD18-T Vector試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生物工程有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)，分析純。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：用于大腸桿菌及大腸桿菌轉(zhuǎn)化子（加Amp后使用，每50 mL培養(yǎng)基加50 μL Amp）的培養(yǎng)、篩選。10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，5 g·L-1NaCl，15 g·L-1瓊脂（Agar）配制固體培養(yǎng)基。1.05 kg·cm-2、121℃條件下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 哈茨木霉幾丁質(zhì)酶Chit42基因的誘導(dǎo)表達(dá)

8是一個(gè)吉利的數(shù)字，在中國(guó)人的傳統(tǒng)語(yǔ)境中，8意味著財(cái)富的增長(zhǎng)。但是在這個(gè)尾數(shù)是8的年份里，很多民眾的感受中，這并不是一個(gè)好的年景。中國(guó)股市復(fù)制了2008年的大跌模式，股指在2018年開市的最后一天回落至2500點(diǎn)以下收盤，全年跌幅超過(guò)四分之一，1.46億股民人均虧損近10萬(wàn)元?！岸艘?guī)則”也被輕易打破，僅有一成股民僥幸賺了點(diǎn)錢。對(duì)于中國(guó)股市，這顯然是一個(gè)沒能逾越的寒冬。

將哈茨木霉（Trichoderma harzianum）接種到PDA培養(yǎng)基上活化，25℃恒溫箱中培養(yǎng)5～8 d，直至產(chǎn)生大量綠色孢子，5 mL滅菌水浸泡3～5 min，輕刮洗下分生孢子，按8%的接種量接種至裝有50 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于恒溫?fù)u床，25℃，180 r·min-1培養(yǎng)5 d。

1.2.2 哈茨木霉總RNA的提取

將0.1 g菌絲置于研缽中，加入液氮充分研磨，迅速加入1.0 mL Trizol，劇烈震蕩混勻，以剪切基因組DNA；加入200 μL氯仿/異戊醇（24∶1），劇烈振蕩混勻30 s；4 ℃，12 000 r·min-1，離心5 min；將含有RNA的上清液小心轉(zhuǎn)移到RNase-free 1.5 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫放置5 min；4 ℃，12 000 r·min-1，離心5 min，小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失；用75%乙醇（DEPC水配制）洗滌兩次，每次700 μL，12 000 r·min-1，4 ℃離心2 min，盡可能徹底吸走上清，防止RNA沉淀丟失。真空離心干燥3～5 min，或放在室溫下使酒精完全揮發(fā)；沉淀用50 μL DEPC-H2O溶解。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，68℃處理10 min。吸取3～5 μL RNA溶液用于下步檢測(cè)反應(yīng)，其余RNA溶液貯存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 哈茨木霉總RNA的質(zhì)量檢驗(yàn)

對(duì)制備的RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280比值。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄為cDNA的體系設(shè)定及反應(yīng)條件

反轉(zhuǎn)錄體系：總 RNA 3 μL（約 1 μg），Oligo（dT）引物 1 μL，ddH2O 9 μL，混勻，稍離心，70℃，5 min，立即置于冰上，冷卻2 min，稍混勻離心，按順序加入下列物質(zhì)：5×Buffer 5 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1） 0.5 μL，RNA酶抑制劑（25 U）1 μL，MMLV 1 μL，混勻稍離心，42 ℃反應(yīng)90 min。反應(yīng)完成后，存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 常規(guī)PCR擴(kuò)增

Chit42H：5'CCAAGCTTACCTCTACCAACATC ACAAGCAA 3'

Chit42N：5'CGGCGGCCGCCAGCCTAGTTCAG ACCATTC 3'

以哈茨木霉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每50 μL 體系：10×Taq Buffer（含 Mg2+）5 μL；dNTP（2.0 mmol·L-1）5 μL，引物各 1 μL（0.5 μmol·L-1），模板cDNA 2 μL，Easy-Taq 0.5 μL，ddH2O 35.5 μL。幾丁質(zhì)酶基因Chi42擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃，2 min；94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，1 min，共35個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后72℃延伸10 min。

1.2.6 Error-prone PCR擴(kuò)增

以克隆的哈茨木霉幾丁質(zhì)酶基因?yàn)槟０?，在常?guī)PCR基礎(chǔ)上，嘗試以下反應(yīng)條件以及條件組合：①M(fèi)nCl2濃度分別為：0、0.2、0.4、0.5、0.6 mmol·L-1；② MgCl2濃度分別為：1.5、2.5、5.0、6.0、7.0 mmol·L-1；③ dATP，dGTP 濃度為 0.04 mmol·L-1；dCTP，dTTP 終濃度梯度為 0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1；④不同突變條件的聯(lián)合應(yīng)用。

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，為獲得適宜的突變率，將影響突變率的因素組合。保持其他組分和擴(kuò)增條件不變，在 5.0 mmol·L-1Mg2+、0.5 mmol·L-1Mn2+、1.5 mmol·L-1dCTP和dTTP條件下進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增。

1.2.7 Error-prone PCR引入突變的鑒定

瓊脂糖電泳分離易錯(cuò)PCR產(chǎn)物，切下所需條帶，電洗脫回收，使用pMD18-T載體系統(tǒng)，按廠家提供的操作程序克隆到pMD18-T中，隨機(jī)挑選克隆，送華大基因公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增Chit42基因

2.1.1 哈茨木霉總RNA的提取

由圖1可知，RNA由3條譜帶組成：分別是28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA。并且28SrRNA與18SrRNA條帶亮度比大于2∶1。紫外分光光度檢測(cè)A260/A280比值為1.95，說(shuō)明總RNA質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 哈茨木霉總RNAFig.1 Total RNA electrophoresis results of Trichoderma harzianum

2.1.2 RT-PCR擴(kuò)增Chit42基因

以哈茨木霉cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（見圖2）。結(jié)果表明擴(kuò)增得到1 300 bp左右的片段，與預(yù)期條帶大小相符。將此片段回收，回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落PCR以及酶切鑒定后，送菌液測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)，與哈茨木霉幾丁質(zhì)酶Chit42 cDNA（S78423）序列同源性達(dá)100%。

圖2 RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果分析Fig.2 Electrophoresis analysis of RT-PCR amplification products

2.2 Error-prone PCR條件的確定

2.2.1 Mg2+濃度條件的確定

Mg2+的作用主要是dNTP-Mg與核酸骨架相互作用，增加Mg2+濃度能夠穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對(duì)并能影響DNA聚合酶的活性，因此高濃度Mg2+可增加PCR非特異性擴(kuò)增的效率，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而擴(kuò)增不出條帶。不同Mg2+濃度下PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3，可見濃度1.5、2.5、5.0 mmol·L-1均能擴(kuò)增出目的片段，濃度為6.0、7.0 mmol·L-1無(wú)條帶檢出。

圖3 不同Mg2+濃度下的Error-prone PCRFig.3 Error-prone PCR results conducted with different Mg2+concentration

2.2.2 Mn2+濃度條件的確定

Mn2+在PCR中通常作為替代Mg2+的天然輔助因子，MnCl2能夠降低聚合酶對(duì)模板的特異性，因此Mn2+的加入更有助于突變的發(fā)生。不同Mn2+濃度下PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4，可見濃度為0.6 mmol·L-1時(shí)，基本得不到擴(kuò)增產(chǎn)物，因此控制Mn2+的最高濃度為0.5 mmol·L-1。

2.2.3 dNTP濃度條件的確定

在Error-prone PCR中，將dATP、dGTP降至常規(guī)PCR濃度的20%，增加某些dNTP的濃度能夠促進(jìn)錯(cuò)誤摻入。不同dCTP、dTTP濃度下PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖5?？梢奷CTP、dTTP濃度2.0 mmol·L-1時(shí)無(wú)目的條帶檢出，因此控制dNTP各濃度配比為：dATP、dGTP 0.04 mmol·L-1；dCTP、dTTP最大濃度控制在1.5 mmol·L-1。

圖5 不同dNTP配比下的Error-prone PCRFig.5 Error-prone PCR conducted with different dNTP concentration

2.2.4 不同突變條件的聯(lián)合應(yīng)用

根據(jù)離子濃度、dNTP配比的試驗(yàn)結(jié)果，為獲得適宜的突變率，將影響突變率的因素組合。保持Error-prone PCR的其他組分和擴(kuò)增條件不變，在5.0 mmol·L-1Mg2+，0.5 mmol·L-1Mn2+，0.04 mmol·L-1dATP和dGTP，1.5 mmol·L-1dTTP和dCTP條件下進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見圖6，可見在該條件下擴(kuò)增良好。

圖6 Error-prone PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果分析Fig.6 Electrophoresis analysis of Error-prone PCR products

2.2.5 Error-prone PCR致Chit42突變結(jié)果

共測(cè)定10個(gè)克隆，累積13 370個(gè)堿基，檢測(cè)到57個(gè)突變，平均突變率為0.4%（見表1）。說(shuō)明濃度為5.0 mmol·L-1Mg2+和0.5 mmol·L-1Mn2+，配合濃度為 0.04 mmol·L-1dATP，dGTP；1.5 mmol·L-1dTTP和dCTP，能夠有效的進(jìn)行Error-prone PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)堿基的突變。

表1 錯(cuò)配PCR形成隨機(jī)突變的類型Table1 Types of random mutation introduced by Error-prone PCR

3 討論

隨著基因工程發(fā)展及生物信息學(xué)對(duì)蛋白質(zhì)功能分析深入，已開始在分子水平上對(duì)酶進(jìn)行定向進(jìn)化[10]。易錯(cuò)PCR進(jìn)行隨機(jī)突變簡(jiǎn)便易行，容易引入突變，突變頻率高于傳統(tǒng)的化學(xué)和物理誘變[11]，是目前實(shí)驗(yàn)室常用的蛋白質(zhì)分子改造方法。一般易錯(cuò)PCR產(chǎn)生的突變率范圍為0.2%～2%。結(jié)果共測(cè)定10個(gè)克隆，累積13 370個(gè)堿基，檢測(cè)到57個(gè)突變，均為點(diǎn)突變，未出現(xiàn)缺失和插入性突變，平均突變率為0.4%。發(fā)生于A/T的突變占75.4%（43/57），其中轉(zhuǎn)換（A→G，T→C）占52.6%，顛換（A→T，T→A；A→C，T→G）占 22.8%（A→T，T→A：19.3%；A→C，T→G：3.5%）。而發(fā)生于G/C的突變只占24.6%（14/57），其中轉(zhuǎn)換（G→A，C→T）占22.8%，顛換（G→T，C→A）占1.8%，CG→GC的顛換突變未見產(chǎn)生。突變后生成A/T的占43.9%（25/57），生成C/G的占56.1%（32/57）。堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換的比例遠(yuǎn)大于顛換，表明在易錯(cuò)PCR過(guò)程中，堿基突變具有一定偏向性。可見在Errorprone PCR中，提高M(jìn)g2+濃度穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對(duì)；引入Mn2+降低聚合酶對(duì)模板的特異性；降低dATP，dGTP濃度，增加dCTP，dTTP濃度促進(jìn)錯(cuò)誤摻入，能夠有效實(shí)現(xiàn)堿基突變，為后期建立突變庫(kù)，篩選優(yōu)良突變株、酶分子定向進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。

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