于洪春，王雨薇，宋龍騰，鄧佳佳，許國(guó)慶

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，沈陽 110161）

八字地老虎（Xestia c-nigrum）屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），分布于世界各地，是地老虎的重要種類之一，也是黑龍江省最常發(fā)生的一種地老虎害蟲，其寄主范圍廣泛，對(duì)蔬菜、甜菜、煙草、馬鈴薯、豆類、玉米、林木等植物幼苗均可造成危害[1-3]。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)地老虎的防治仍以化學(xué)防治為主，生物防治報(bào)道較少?，F(xiàn)有八字地老虎生物防治報(bào)道主要限于八字地老虎核型多角體病毒研究[4-7]，而蘇云金桿菌（Bt）對(duì)八字地老虎研究目前還未見報(bào)道。由于蘇云金桿菌是應(yīng)用最廣泛的昆蟲病原微生物之一，且其株系豐富，含有的殺蟲晶體蛋白基因有較大差異，因此殺蟲譜范圍會(huì)存在較大不同。

文章通過50株Bt菌株對(duì)八字地老虎幼蟲室內(nèi)的生物測(cè)定，以期篩選出對(duì)八字地老虎幼蟲有較高毒力的Bt菌株，為研制和開發(fā)防治地老虎的生物制劑提供依據(jù)，為八字地老虎的生物防治開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx與食料

供試?yán)ハx來自于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站內(nèi)黑光燈下誘集的八字地老虎成蟲卵孵化出的幼蟲。食料為新鮮白菜（Brassica chinensis L.）葉片。

1.1.2 供試菌株

供試菌株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)系害蟲生物防治研究室提供，共50株Bt菌株。

1.1.3 培養(yǎng)基

Bt培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，瓊脂2%，pH 7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與芽孢計(jì)數(shù)

采用試管斜面接種培養(yǎng)法，在28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，用無菌蒸餾水將蘇云金桿菌制成懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)芽孢數(shù)，每菌株計(jì)數(shù)3次重復(fù)，以求得每小格芽孢數(shù)的平均數(shù)。

各個(gè)菌株芽孢濃度（cfu·mL-1）=每小格內(nèi)芽孢數(shù)平均數(shù)×4×106；

各個(gè)菌株原液芽孢濃度（cfu·mL-1）=每小格內(nèi)芽孢數(shù)平均數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù)。

1.2.2 生物測(cè)定

室內(nèi)生物測(cè)定方法采用白菜浸漬法[8]，將新鮮白菜葉分別浸泡在50株芽孢濃度均為1×107cfu·mL-1的Bt菌液中，待整個(gè)葉片全部沾有菌液時(shí)取出，陰干之后飼喂4日齡八字地老虎幼蟲，并設(shè)清水為對(duì)照。每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)20頭幼蟲。幼蟲飼養(yǎng)在25°C，相對(duì)濕度70%，光周期L14∶D10的人工氣候箱中。每天更換1次新鮮無毒食料，并記錄死亡蟲數(shù)。在菌液處理72、120和168 h后分別計(jì)算死亡率和校正死亡率。

死亡率（%）=（試蟲總數(shù)-活蟲數(shù)）/試蟲總數(shù)×100；

校正死亡率（%）=（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）×100。

在初篩試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇校正死亡率較高的Bt菌株 5株，分別將其配制成 5×108、1×108、2×107、4×106、8×105cfu·mL-1等5個(gè)不同濃度的菌液，并設(shè)清水為對(duì)照，按前述方法對(duì)5日齡八字地老虎幼蟲進(jìn)行生物測(cè)定，計(jì)算在菌液處理后1、3、5、7、9、10 d幼蟲的死亡率和校正死亡率。以菌液濃度、處理時(shí)間（d）與累計(jì)校正死亡率為參數(shù)，用DPS v7.0.5軟件進(jìn)行生物測(cè)定數(shù)據(jù)處理（對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換）與分析，獲得八字地老虎幼蟲5、7、10 d的濃度與校正死亡率的毒力回歸方程，求出各菌株LC50值；同時(shí)獲得各菌株在濃度5×108、1×108cfu·mL-1時(shí)的死亡時(shí)間與校正死亡率的回歸方程，求出各菌株的LT50、LT70和LT90。通過參數(shù)比較，篩選出毒力最強(qiáng)的Bt菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)八字地老虎高毒力Bt菌株初步篩選

50株Bt菌株以濃度為1×107cfu·mL-1的菌液處理4日齡八字地老虎幼蟲，在72、120、168 h的死亡率和校正死亡率見表1。

用DPS v7.05軟件對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)差異顯著性分析，結(jié)果表明，各供試Bt菌株在72 h（df=49，F(xiàn)=12.419，P=0.0001＜0.01）、120 h（df=49，F(xiàn)=11.408，P=0.0001＜0.01）、168 h（df=49，F(xiàn)=5.849，P=0.0001＜0.01）對(duì)八字地老虎幼蟲的校正死亡率差異均達(dá)極顯著水平，證實(shí)蘇云金桿菌不同菌株對(duì)八字地老虎幼蟲的毒力存在很大差異，其72 h校正死亡率為0～48.3%，120 h校正死亡率為-1.7%～93.2%，168 h校正死亡率為-25%～100%。根據(jù)生物測(cè)定結(jié)果，初步篩選出5株對(duì)八字地老虎幼蟲具有較高毒力的蘇云金桿菌菌株Bt15、Bt43、Bt47、Bt65和Bt66，其對(duì)八字地老虎幼蟲在120 h校正死亡率為52.5%～93.2%，168 h校正死亡率為91.6%～100%。

2.2 對(duì)八字地老虎高毒力Bt菌株的進(jìn)一步篩選

將初步篩選出毒力較高的Bt15、Bt43、Bt47、Bt65和Bt66分別等比稀釋成5個(gè)不同濃度，對(duì)5日齡八字地老虎幼蟲進(jìn)行室內(nèi)生物測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 50株Bt菌株對(duì)4日齡八字地老虎幼蟲的毒力初步測(cè)定Table1 Preliminary determination of virulence of 50 Bt strains to larvae of 4 day-old Xestia c-nigrum

續(xù)表

表2 5株Bt菌株對(duì)八字地老虎幼蟲的致死濃度Table2 Median lethal concentration of five Bt strains to 5 day-old larvae of Xestia c-nigrum

從表2可以看出，初篩獲得的5株Bt菌株在第5天、7天、10天的校正死亡率隨芽孢濃度升高而升高，隨濃度降低而降低。方差分析結(jié)果表明，同一Bt菌株中，高濃度與低濃度對(duì)八字地老虎幼蟲校正死亡率達(dá)極顯著差異（P＜0.01）。

以上述5株Bt菌株濃度的對(duì)數(shù)和校正死亡率為參數(shù)，用DPS v7.0.5軟件進(jìn)行生物測(cè)定數(shù)據(jù)處理（對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換）與分析，獲得其對(duì)八字地老虎5日齡幼蟲5、7、10 d的毒力回歸方程分別為：菌株Bt15，y=28.61353x-177.58825，r=0.944799； y=37.42650x-226.25199，r=0.983670； y=36.72547x-206.81374，r=0.931267；菌株 Bt43，y=13.83464x-72.68714，r=0.741509； y=31.00276x-180.03209，r=0.946692；y=35.28048x-198.24387，r=0.944261；菌株 Bt47，y=15.25101x-89.66810，r=0.868809；y=22.17549x-125.88389，r=0.805321； y=32.44774x-183.22195，r=0.937154；菌株 Bt65，y=25.03684x-152.49472，r=0.973726； y=30.74524x-182.13192，r=0.921635；y=33.86411x-189.92291，r=0.967302；菌株 Bt66，y=20.50160x-118.34276，r=0.877489；y=24.79362x-141.01900，r=0.857041； y=35.06588x-196.35706，r=0.907212。根據(jù)獲得各菌株的毒力回歸方程，求出各菌株在飼喂菌液后5、7、10 d的LC50值，其結(jié)果見表2。

5株菌株在5×108、1×108cfu·mL-1濃度下校正死亡率與致死時(shí)間的回歸方程和LT50、LT70和LT90值見表3。

表3結(jié)果表明，菌株Bt15對(duì)5日齡八字地老虎致死時(shí)間最短，在5×108cfu·mL-1濃度下，其LT50、LT70和LT90分別較其他4株菌株短1.02～3.33、1.81～5.58、3.72～11.85 d；在1×108cfu·mL-1濃度下，分別短0.51～1.71、0.85～4.92、1.75～16.53 d。說明菌株Bt15對(duì)八字地老虎幼蟲殺蟲速度優(yōu)于其他Bt菌株。

表3 5株Bt菌株對(duì)5日齡八字地老虎的致死時(shí)間Table3 Lethal time of five Bt strains to 5 day-old larvae of Xestia c-nigrum

綜合表2、表3結(jié)果，通過各Bt菌株LC50和LT50、LT70和LT90的比較，在初篩獲得的毒力較高的5株菌株中，菌株Bt15在第5天、7天、10天的LC50值和LT50、LT70和LT90值均低于其余4株菌株，表明該菌株對(duì)八字地老虎幼蟲的生物活性最強(qiáng)，毒力最高。因此，Bt15菌株為篩選到的防治八字地老虎幼蟲的最佳Bt菌株。

3 討論

目前，對(duì)八字地老虎的防治以采用擬除蟲菊酯類和有機(jī)磷農(nóng)藥噴霧和土壤處理為主，生物防治研究報(bào)道較少。已有報(bào)道中，分離出的八字地老虎核型多角體病毒對(duì)八字地老虎有一定的防治效果[6-7,9]。斯氏線蟲室內(nèi)生物測(cè)定對(duì)八字地老虎有一定侵染力[10]。一般認(rèn)為，蘇云金桿菌對(duì)鱗翅目夜蛾科害蟲防治效果不佳，而地老虎在昆蟲分類上屬于鱗翅目夜蛾科，所以蘇云金桿菌防治地老虎的研究報(bào)道較少。楊建全等測(cè)定4株Bt菌株對(duì)小地老虎1齡幼蟲的毒力，其毒力最高菌株校正死亡率可達(dá)66.7%，LC50=1.7152×109cfu·mL-1，并發(fā)現(xiàn)幼蟲對(duì)Bt處理的葉片有拒食現(xiàn)象，幼蟲增重明顯低于對(duì)照[11]。束長(zhǎng)龍等篩選并測(cè)定了不同Bt菌株對(duì)小地老虎的毒力作用，發(fā)現(xiàn)表達(dá)Cry2Ab殺蟲蛋白的菌液對(duì)小地老虎的生長(zhǎng)發(fā)育有明顯抑制作用[12]。陸瓊等進(jìn)一步證實(shí)Cry2Ab對(duì)小地老虎的殺蟲活性[13]。所以，從大量的不同Bt菌株中有望篩選出對(duì)地老虎有較高活性的高毒力菌株。

利用蘇云金桿菌防治八字地老虎是一種可行的生物防治措施，為八字地老虎的生物防治開辟新途徑。本研究建立芽孢濃度與八字地老虎幼蟲死亡率和毒力的關(guān)系，但致昆蟲死亡的另一主要原因是Bt殺蟲晶體蛋白，因此還需深入研究殺蟲晶體蛋白與毒力的相互關(guān)系，以確定所篩選菌株的基因型。

[1]席景會(huì),潘洪玉,陳玉江,等.四種食料植物對(duì)八字地老虎生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的影響[J].昆蟲知識(shí),2002,39(6):428-429.

[2]蔡志平,張棟海,李克福,等.新疆小海子墾區(qū)果棉間作田黃地老虎、警紋地老虎和八字地老虎成蟲種群動(dòng)態(tài)[J].中國(guó)棉花,2012(3):22-24.

[3]鄭英榮,王維升.八字地老虎在北方地區(qū)生物學(xué)特性觀察[J].吉林農(nóng)業(yè),2010,250(12):109.

[4]鄭桂玲,李長(zhǎng)友,張履鴻,等.八字地老虎核型多角體病毒的形態(tài)發(fā)生[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,27(1):44-49.

[5]倪巖松,張履鴻,周彥武.八字地老虎核型多角體病毒的研究[J].東北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1991,22(1):20-24.

[6]席景會(huì),潘洪玉,劉偉成,等.八字地老虎核型多角體病毒對(duì)宿主昆蟲繁殖潛勢(shì)的影響[J].中國(guó)病毒學(xué):殺蟲微生物?？?2000,15:76-80.

[7]鄭桂玲,李長(zhǎng)友,張履鴻,等.八字地老虎核型多角體病毒的寄主范圍和室內(nèi)增殖以及寄主組織病理的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,29(4):340-344.

[8]慕立義.植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1994:47-62.

[9]席景會(huì),潘洪玉,劉偉成,等.八字地老虎核型多角體病毒對(duì)宿主的弱化作用[J].昆蟲天敵,2000,22(2):75-78.

[10]趙奎軍,宋捷,張麗坤,等.斯氏線蟲對(duì)兩種地老虎的侵染效果[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1995,26(3):242-246.

[11]楊建全,李芳,陳家驊,等.蘇云金桿菌對(duì)小地老虎的毒力測(cè)定[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,29(1):65-68.

[12]束長(zhǎng)龍,谷少華,竇黎明,等.對(duì)小地老虎具有殺蟲毒力的蘇云金芽孢桿菌菌株的分離及鑒定[J].植物保護(hù),2007,33(5):41-44.

[13]陸瓊,張永軍,于洪春,等.Cry2Ab殺蟲蛋白對(duì)小地老虎幼蟲致死效果及體內(nèi)酶活性的影響[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),2009,36(1):16-20.