李 晶，蒿連梅，王洪波

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

芥子油苷（Glucosinolate）是一類含氮、含硫的植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于十字花科植物中，由β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基團(tuán)以及來源于氨基酸的側(cè)鏈R基組成。根據(jù)側(cè)鏈氨基酸來源的不同，芥子油苷分為來源于甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的脂肪族芥子油苷，來源于色氨酸的吲哚族芥子油苷、來源于苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族芥子油苷。芥子油苷及其水解產(chǎn)物具有多種不同的生物活性，可參與植物對(duì)病原菌、昆蟲侵害等生物脅迫的防御性反應(yīng)[1-4]。研究表明某些脂肪族芥子油苷具有抗癌活性，是迄今在植物中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗癌活性物質(zhì)[5-8]。近年來關(guān)于芥子油苷代謝調(diào)控的研究已成為植物次生代謝領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

擬南芥中MYB51轉(zhuǎn)錄因子是一類R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子，主要參與調(diào)控吲哚族芥子油苷的代謝。當(dāng)擬南芥受到外源病菌侵染時(shí)，MYB51轉(zhuǎn)錄因子通過增加吲哚族芥子油苷含量參與植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)[9-10]。在擬南芥中過量表達(dá)MYB51基因后，吲哚族芥子油苷含量升高，對(duì)廣食性鱗翅目類昆蟲甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）與粉文夜蛾（Trichoplusia ni）也表現(xiàn)出一定的防御性[11]。Clay等發(fā)現(xiàn)吲哚族芥子油苷的降解產(chǎn)物參與病原菌誘導(dǎo)的細(xì)胞壁胼胝脂累積，從而使植物獲得廣譜抗病性[12]。水楊酸與茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)途徑與植物抗病性防御反應(yīng)密切相關(guān)[13-14]。研究表明，擬南芥葉片受到病原菌侵染后，芥子油苷種類和含量發(fā)生顯著變化，且有可能通過參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動(dòng)相應(yīng)的防御性反應(yīng)[15]。

為深入了解MYB51對(duì)不同結(jié)構(gòu)芥子油苷合成代謝的調(diào)控及芥子油苷參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能性，構(gòu)建過量表達(dá)MYB51基因的植物表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入擬南芥，采用RT-PCR方法，系統(tǒng)分析吲哚族芥子油苷合成酶基因、脂肪族芥子油苷合成酶基因以及水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的標(biāo)記基因表達(dá)變化。研究結(jié)果初步揭示了MYB51轉(zhuǎn)錄因子在芥子油苷代謝途徑中的調(diào)控作用，MYB51可以促進(jìn)吲哚族芥子油苷的合成，但同時(shí)抑制脂肪族芥子油苷的合成，對(duì)兩種不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的芥子油苷的相對(duì)比例起協(xié)調(diào)作用，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的標(biāo)記基因變化說明吲哚族芥子油苷可能直接或間接參與茉莉酸和水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可為MYB51轉(zhuǎn)錄因子在整個(gè)芥子油苷代謝網(wǎng)絡(luò)中的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥（哥倫比亞生態(tài)型）種子4℃春化3 d后播種于由蛭石與黑土比例為1∶1的土中，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度23℃，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度7 000 lx，光照長(zhǎng)度16 h·d-1。

大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404等材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物次生代謝研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 MYB51基因在擬南芥中的過量表達(dá)

1.2.1.1 MYB51基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

取生長(zhǎng)三周的擬南芥幼嫩葉片，采用Trizol（Invitrogen）試劑按照產(chǎn)品說明書提取總RNA。以總RNA為模板，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)li?go dT為引物合成cDNA第一條鏈，再以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增MYB51基因的編碼序列。引物序列為 5'ggcttaaUATGGTGCGGACACCGTGT3'和 5'ggtt?taaUTCATCCAAAATAGTTATCAATTTCG 3'。

以pCAMBIA230035Su載體為基礎(chǔ)[16]，經(jīng)PacⅠ和Nt.BbvCIB酶切后，將上述克隆獲得的MYB51基因片段連入植物表達(dá)載體，構(gòu)建成由組成型啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)的過量表達(dá)MYB51基因的植物表達(dá)載體。

1.2.1.2 MYB51基因?qū)M南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

將上述獲得的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)測(cè)序證明所獲得DNA序列準(zhǔn)確無誤后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥[17]，用含有50 mg·L-1卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基篩選抗性植株?？剐灾仓暌圃运闹芎蠓謩e提取DNA和RNA，進(jìn)行外源基因整合的PCR鑒定和目的基因表達(dá)水平的RT-PCR檢測(cè)。

1.2.1.3 轉(zhuǎn)基因植株中外源基因整合情況的分子鑒定

取擬南芥T1代抗性植株葉片，用DNA提取試劑盒（Easy pure plant genomic DNA extraction kit）提取基因組DNA。為避免擬南芥內(nèi)源MYB51基因的干擾，采用MYB51基因特異性引物和植物表達(dá)載體特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。引物序列為：5'TT?GCGATAAAGGAAAGGC3'和 5'TCATCCAAAA TAGTTATCAATTTCG 3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 308 bp。

1.2.1.4 轉(zhuǎn)基因植株中MYB51表達(dá)水平的檢測(cè)

取上述PCR檢測(cè)為陽性的植株葉片，用RNA prep Plant Kit試劑盒提取樣品的總RNA，以TaKa?Ra反轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA第一條鏈，以5'TCTGTCTGAGATTATCGGAAGTGG 3'和5'CCAACGAAATTATCGCAGTACATTAG 3'為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段長(zhǎng)度為270 bp。

內(nèi)參基因ACTIN2的RT-PCR引物為5'CCATC CTCCGTCTTGACCTT3'和5'ACTTGCCCATCGGGT AATTC 3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約200 bp。

1.2.2 過量表達(dá)MYB51的轉(zhuǎn)基因植株中吲哚族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)分析

分別取生長(zhǎng)六周的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片，提取RNA并制備cDNA，方法如上所述。對(duì)幾種主要的吲哚族芥子油苷合成酶基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，所需引物序列如下。CYP79A2的引物為5'CGATGGGCACGGAGTACTG 3'和5'CAAAGG CGTAAAGATGGGTTAA 3'；CYP79B2的引物為5'ACCGTAGAAGATGTAGAGCACATG 3'和5'GCTC CTTAATGGTGGGTTTGATT 3'；CYP79B3 的引物為5'GTGGACCGACTTTGGAAGATATC 3'和5'CGGC TTTGATGGGTTGTCT 3'；CYP83B1的引物為5'GAAAGGGCAACAAACCATGTC 3'和5'GGTTGTA AGGAATCCGAAATAA 3'。

1.2.3 過量表達(dá)MYB51的轉(zhuǎn)基因植株中脂肪族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)分析

分別取生長(zhǎng)六周的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片，提取RNA并制備cDNA，方法如上所述。對(duì)幾種主要的脂肪族芥子油苷合成酶基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，所需引物序列如下。CYP79F1的引物為5'AAGCGGATAATCTCATAGCTTACG 3'和5'CC AATCTTCAACAGCAGCCTTA 3'；CYP79F2 的 引 物為5'TGGTTAGGTGGTTGGAATATTGA 3'和5'CCC AAGGGTGGTATCTTGACG 3'。

1.2.4 過量表達(dá)MYB51的轉(zhuǎn)基因植株中水楊酸與茉莉酸信號(hào)途徑標(biāo)記基因的表達(dá)分析

分別取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片，提取RNA并制備cDNA，方法如上所述。分別對(duì)水楊酸信號(hào)途徑標(biāo)記基因PR1、PR2與茉莉酸信號(hào)途徑標(biāo)記基因PDF1.2的表達(dá)水平進(jìn)行分析，所需引物序列如下。PR1的引物為5'TTCACAACCAGGCAC?GAGG 3'和 5'TGTTACACCTCACTTTGGCACAT 3'；PR2的引物為5'GGCTCTTTACAAACAACAAAA?CATC 3'和5'TCTTATACTCATCCCTGAACCTTCC 3'；PDF1.2 的引物為 5'ATGGCTAAGTTTGCTTC?CATCA 3'和 5'TTAACATGGGACGTAACAGATA?CAC 3'。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYB51基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以擬南芥三周大葉片的cDNA為模板經(jīng)RTPCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1 059 bp的基因片段如圖1所示，經(jīng)測(cè)序證明與擬南芥的MYB51基因CDS序列一致。以植物表達(dá)載體pCAMBIA230035Su為基礎(chǔ)，經(jīng)PacⅠ和Nt.BbvCIB酶切后，將上述克隆獲得的MYB51基因片段連入載體，構(gòu)建成由組成型啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)的過量表達(dá)MYB51基因的植物表達(dá)載體（以下稱35S∶MYB51）。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法將上述構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥。經(jīng)篩選獲得具有卡那霉素抗性的植株40株。

圖1 MYB51基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification of MYB51

2.2 MYB51轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

2.2.1 轉(zhuǎn)基因植株中外源基因整合情況的PCR鑒定

以植物表達(dá)載體序列特異引物和MYB51基因特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，在40株抗性植株中均能擴(kuò)增到長(zhǎng)度約為1 308 bp的預(yù)期片段。35S:MYB51轉(zhuǎn)基因植株的部分PCR鑒定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明MYB51基因已整合至擬南芥的基因組中。

圖2 轉(zhuǎn)MYB51 T1代抗性植株的PCR檢測(cè)Fig.2 PCR confermation of T135S:MYB51 transgenic plants

2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株中MYB51表達(dá)水平的RT-PCR鑒定

進(jìn)一步通過半定量RT-PCR方法檢測(cè)T1代PCR陽性植株中MYB51是否超表達(dá)。選擇PCR陽性植株10株，獲得6個(gè)超表達(dá)株系#L1、#L2、#L3、#L4、#L5和#L6，MYB51在這6個(gè)株系中超量表達(dá)（見圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株中MYB51的表達(dá)Fig.3 Expression level of MYB51 in transgenic plants

2.3 過量表達(dá)MYB51基因?qū)胚嶙褰孀佑蛙蘸铣擅富虻挠绊?/h3>

用半定量RT-PCR方法，分析35S:MYB51轉(zhuǎn)基因植株中吲哚族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與野生型相比轉(zhuǎn)基因植株中吲哚族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)發(fā)生不同程度改變。

如圖4所示，CYP79A2和CYP79B2基因在35S∶MYB51植株中的表達(dá)顯著高于野生型植株。CYP79B3在35S∶MYB51植株中的表達(dá)量稍高于野生型。CYP83B1基因的表達(dá)量與野生型相比變化不太明顯。以上結(jié)果說明在過表達(dá)MYB51基因的植株中吲哚族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)水平普遍上升，MYB51轉(zhuǎn)錄因子對(duì)吲哚族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)有促進(jìn)作用。

圖4 35S:MYB51中吲哚族芥子油苷合成酶基因表達(dá)水平的變化Fig.4 Expression of indolic glucosinolates biosynthetic genes in 35S:MYB51

2.4 過量表達(dá)MYB51基因?qū)χ咀褰孀佑蛙蘸铣擅富虻挠绊?/h3>

CYP79F1與CYP79F2基因是脂肪族芥子油苷合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，半定量RT-PCR分析表明過表達(dá)MYB51基因的植株中，CYP79F1與CYP79F2基因的表達(dá)量降低（見圖5）。說明MYB51轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脂肪族芥子油苷合成酶基因CYP79F1與CYP79F2的表達(dá)有一定抑制作用。

圖5 35S:MYB51中脂肪族芥子油苷合成酶基因表達(dá)水平的變化Fig.5 Expression of aliphatic glucosinolates biosynthetic genes in 35S:MYB51

2.5 過量表達(dá)MYB51基因?qū)λ畻钏岷蛙岳蛩嵝盘?hào)途徑標(biāo)記基因的影響

PR1、PR2基因是水楊酸信號(hào)途徑的標(biāo)記基因，PDF1.2為茉莉酸信號(hào)途徑的標(biāo)記基因。在過表達(dá)MYB51基因的植株中，PR1與PR2基因的表達(dá)量降低。PDF1.2基因的表達(dá)量則顯著升高，如圖6所示。可以說明MYB51轉(zhuǎn)錄因子抑制PR1與PR2基因的表達(dá)，而強(qiáng)烈誘導(dǎo)PDF1.2基因的表達(dá)。

圖6 35S:MYB51中水楊酸和茉莉酸信號(hào)途徑標(biāo)記基因表達(dá)水平的變化Fig.6 Expression of JA-signal marker genes and SA signal marker gene in 35S:MYB51

3 討論

芥子油苷及其降解產(chǎn)物在植物抗生物脅迫的防御性反應(yīng)中起重要作用[18]。脂肪族和吲哚族芥子油苷是擬南芥中主要的芥子油苷類型，其中吲哚族芥子油苷合成主要由轉(zhuǎn)錄因子MYB51調(diào)控[19-20]。近年大量研究表明，吲哚族芥子油苷的代謝途徑在植物抗病性防御反應(yīng)中必不可少[21-23]，其重要性和作用機(jī)制的復(fù)雜性似乎超出預(yù)測(cè)。吲哚族芥子油苷對(duì)病原菌和昆蟲的防御作用一直被歸結(jié)于化學(xué)毒性，直至發(fā)現(xiàn)吲哚族芥子油苷的水解產(chǎn)物參與細(xì)胞壁胼胝脂合成從而引發(fā)植物廣譜抗菌性。這一新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)使吲哚族芥子油苷的合成、調(diào)控及其抗生物脅迫機(jī)制的研究受到極大關(guān)注[24]。

本研究將MYB51基因轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得PCR檢測(cè)為陽性并過量表達(dá)MYB51的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中芥子油苷合成途徑相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，過量表達(dá)MYB51基因?qū)胚嶙褰孀佑蛙蘸铣擅富虻谋磉_(dá)有促進(jìn)作用，而對(duì)脂肪族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)有抑制作用，脂肪族芥子油苷的合成與吲哚族芥子油苷的合成之間的關(guān)系有兩種可能：一種是反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，當(dāng)MYB51基因過量表達(dá)時(shí)，激活吲哚族芥子油苷合成酶基因，使吲哚族芥子油苷大量積累，促使植物體內(nèi)的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制啟動(dòng)，脂肪族芥子油苷合成酶基因的表達(dá)下降，脂肪族芥子油苷的合成減弱。另一種是相互競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制。MYB51基因過量表達(dá)后，激活吲哚族芥子油苷合成酶基因表達(dá)，消耗大量原料與能量使吲哚族芥子油苷積累，合成脂肪族芥子油苷所需的物質(zhì)能量減少，從而使脂肪族芥子油苷合成酶基因表達(dá)量降低?？梢?，脂肪族芥子油苷和吲哚族芥子油苷之間存在競(jìng)爭(zhēng)和相互制約關(guān)系。

MYB51基因的過量表達(dá)不僅促進(jìn)吲哚族芥子油苷的合成，同時(shí)還導(dǎo)致茉莉酸信號(hào)途徑的增強(qiáng)和水楊酸信號(hào)途徑的減弱，說明吲哚族芥子油苷或者其降解產(chǎn)物可能是通過參與逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動(dòng)相應(yīng)的防御性反應(yīng)。由生物脅迫所誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，芥子油苷如何參與這些途徑，以及除細(xì)胞壁胼胝質(zhì)合成外是否引發(fā)其他的防御性反應(yīng)，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

MYB51轉(zhuǎn)錄因子在芥子油苷合成過程中起重要調(diào)控作用，可促進(jìn)吲哚族芥子油苷的合成，同時(shí)抑制脂肪族芥子油苷的合成。MYB51轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的吲哚族芥子油苷合成途徑可直接或間接地增強(qiáng)茉莉酸信號(hào)途徑并抑制水楊酸途徑，并由此啟動(dòng)相應(yīng)的防御性反應(yīng)。

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