柏 錫，劉 欣,3，翟 紅，朱延明，才 華，紀(jì) 巍，羅 曉

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081；3.黑龍江中科瑞合環(huán)保技術(shù)服務(wù)有限公司，哈爾濱 150090）

干旱、高鹽、低溫等不利環(huán)境條件對(duì)植物生長(zhǎng)有極大危害，但是植物自身會(huì)對(duì)這些脅迫響應(yīng)，從而對(duì)脅迫產(chǎn)生耐性。當(dāng)脅迫來臨時(shí)，與植物細(xì)胞膜表面的一些受體結(jié)合或者導(dǎo)致細(xì)胞膜的物理性質(zhì)發(fā)生改變，通過轉(zhuǎn)錄因子引起下游基因?qū)γ{迫產(chǎn)生響應(yīng)[1-2]。細(xì)胞膜是第一道生理屏障，通過對(duì)編碼細(xì)胞膜相關(guān)基因的研究可進(jìn)一步明確植物對(duì)脅迫的響應(yīng)機(jī)制。

大量研究表明，膜蛋白廣泛的參與到非生物脅迫的過程中。例如，AtHK1是擬南芥中編碼非生物感受器的基因，AtHK1感知質(zhì)膜表面的水勢(shì)，通過對(duì)ABA合成的調(diào)節(jié)，在植株的種子萌發(fā)期和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期對(duì)干旱產(chǎn)生耐性[3]。Qiu等研究表明SOS1是質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，在高Na+條件下，SOS1使Na+流出木質(zhì)部；在低濃度Na+條件下，SOS1只將Na+運(yùn)送到木質(zhì)部[4-5]。

At2g39530屬于UPF0497（Uncharacteristic protein family 0497）家族成員，該家族包含有39個(gè)基因都編碼膜蛋白。Daniele等研究表明，其中Clade II中5個(gè)成員與內(nèi)皮層凱式帶形成有關(guān)，casp1-1、casp3-1雙突變后會(huì)改變凱式帶結(jié)構(gòu)[6]。對(duì)At2g39530的啟動(dòng)子進(jìn)行啟動(dòng)子順式元件分析，發(fā)現(xiàn)具有DRE順式作用元件，DRE是在ABA-非依賴途徑中調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)的順式作用元件[7-8]，因此At2g39530可能受該元件調(diào)控從而對(duì)非生物脅迫具有響應(yīng)作用。

本研究通過Real-time PCR、亞細(xì)胞定位、組織定位分析等方法證明At2g39530的功能及其在非生物脅迫方面的作用，為研究UPF0497家族在非生物脅迫方面的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥（Columbia）在含有0.8%瓊脂的1/2 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。水培法：擬南芥在不含有瓊脂的1/2 MS培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。土壤中種植：在1∶1∶1混合的蛭石∶草炭∶營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度為22℃、光密度為 100 μmol·Photons·m-2·s-1、光周期為光照16 h；黑暗8 h。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用Clustal W軟件對(duì)UPF0497家族成員進(jìn)行序列比對(duì)，用Maga 4.0軟件中的鄰接法進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建[9-10]。在PlantCARE網(wǎng)站上進(jìn)行啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。利用 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 GENEVESTIGATOR（https://www.genevestigator.com/gv/）對(duì)At2g39530和At2g03700的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 擬南芥在冷、干旱、鹽和ABA脅迫下的表達(dá)特性分析

采用水培法，擬南芥在1/2 MS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3周后對(duì)其進(jìn)行脅迫處理，分別將擬南芥幼苗置于含有250 mmol·L-1NaCl，4℃，干旱和50 μmol·L-1ABA的液體1/2MS培養(yǎng)基中，干旱處理將幼苗稱鮮重后放于平板內(nèi)，開蓋置于超凈工作臺(tái)中，使其失水。各種脅迫均含3次生物學(xué)重復(fù)，分別處理0、0.5、3、6 h后取材并且分別提取擬南芥地上和地下部分的RNA。RNA提取采用RNeasy plant mini-kit（TIANGEN）。采用SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶（Introvigen）及Oligo dT作為引物反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA。

Real-time PCR實(shí)驗(yàn)采用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）在 ABI 7 500 Real-time PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件遵循說明書（SYBR Premix Ex Taq II）。試驗(yàn)采用actin2作為內(nèi)參，actin2引物（At3g18780）：5'TTACCCGATGGGCAAGTC 3'和5'GCTCATACGGTCAGCGATAC 3'；At2g39530引物（At2g39530）：5'AATCGAACGGAGTTTGCG 3'和5'TACGGTGATGACGGTGGAG 3'。Real-time PCR數(shù)據(jù)處理采用 2-ΔΔCt的方法[11]。

1.4 組織定位分析

以野生型擬南芥（Col）DNA為模板，At2g39530啟動(dòng)子克隆的PCR引物：5'AATCTTCCCGTTAA TTAATCG 3'和5'CTTGTTTTCTCGAAAGAGTTTG 3'。以NcoⅠ和PstⅠ為酶切位點(diǎn)，將啟動(dòng)子插入到pCAMBIA3301載體上，通過花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥[12]。用50 μg·L-1的固沙草對(duì)種子進(jìn)行篩選。通過GUS染色的方法對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行不同生長(zhǎng)時(shí)期的組織定位分析，方法如Jefferson等所述[13]。用70%乙醇在56℃條件下脫色，在Olympus實(shí)體顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 亞細(xì)胞定位分析

對(duì)At2g39530的亞細(xì)胞定位分析采用基因槍轟擊洋蔥表皮的方法。對(duì)At2g39530終止密碼子突變，構(gòu)建PBSK-At2g39530-eGFP的載體。At2g39530的克隆引物：5'GGAATTCCA TGGCTCCACC 3'和5'GCT CTAGAGCATGAGACTGGAACT 3'。以EcoRⅠ和XbaⅠ為酶切位點(diǎn)，將其構(gòu)建到PBSK-eGFP的載體上。用質(zhì)粒對(duì)洋蔥表皮進(jìn)行基因槍轟擊，洋蔥在1/2 MS培養(yǎng)基上暗處培養(yǎng)8～12 h，在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPF0497蛋白家族基因聚類和啟動(dòng)子序列分析

如圖1所示，通過對(duì)UPF0497（Uncharacteristic protein family 0497）家族進(jìn)行進(jìn)化樹分析，將其分為5個(gè)進(jìn)化枝，與凱式帶形成相關(guān)基因位于Clade I，分別為casp1-casp5。為了研究該家族成員在非生物脅迫中是否具有作用，對(duì)39個(gè)成員啟動(dòng)子進(jìn)行啟動(dòng)子順式元件分析，發(fā)現(xiàn)At2g39530和At2g03700的啟動(dòng)子具有DRE順式作用元件，At2g39530屬于Clade IV，At1g03700屬于Clade II，其同源性不高?；蛐酒瑪?shù)據(jù)表明At2g39530和At2g03700在脅迫下均有響應(yīng)。本文選取At2g39530基因進(jìn)行深入研究。

2.2 脅迫處理下的表達(dá)模式分析

為了研究At2g39530在非生物脅迫下的表達(dá)模式，采用Real-time PCR的方法研究At2g39530的地上和地下部分在鹽、冷、干旱及ABA脅迫下的表達(dá)模式。

2.2.1 At2g39530在擬南芥地上部分的表達(dá)模式

擬南芥的地上部分在鹽處理下，At2g39530在0.5 h有顯著下調(diào)（P＜0.001）（見圖2A），在3 h表達(dá)量倍數(shù)上調(diào)5倍，在6 h表達(dá)量與未處理時(shí)相比上調(diào)2倍。在冷處理下，At2g39530在3 h顯著下調(diào)0.5倍（P＜0.05），在6 h表達(dá)量依然維持在下調(diào)的水平。結(jié)果表明At2g39530在擬南芥的地上部分對(duì)鹽，冷處理均有一定響應(yīng)，但是在干旱和ABA處理下表達(dá)量都沒有顯著差異。

圖1 UPF0497家族成員的進(jìn)化樹構(gòu)建Fig.1 Phylogenetic tree of the UPF0497 family

2.2.2 At2g39530在擬南芥地下部分的表達(dá)模式

At2g39530地下部分在干旱處理下3 h表達(dá)量上升2倍（見圖2B），在6 h下調(diào)表達(dá)（P＜0.05）；在鹽處理下，3 h表達(dá)量上升到3倍，在處理6 h后又回落到2倍，但表達(dá)量仍保持在較高水平。在冷處理下3 h表達(dá)量達(dá)到最高峰，相當(dāng)于未處理時(shí)的3.5倍（P＜0.05）。在ABA處理下At2g39530表達(dá)量變化沒有顯著差異。說明At2g39530在干旱、鹽、冷處理下表達(dá)量均有一定誘導(dǎo)表達(dá)，但是At2g39530在ABA處理下表達(dá)量沒有顯著變化。

圖2 At2g39530在非生物脅迫下的表達(dá)水平分析及在地上部分和地下部分的表達(dá)量分析Fig.2 Evaluation of At2g39530 transcript levels under stress conditions and in shoot and root

通過對(duì)擬南芥在未處理時(shí)地上和地下部分的表達(dá)數(shù)據(jù)分析，表明At2g39530在擬南芥根中的表達(dá)量是地上部分的20倍（見圖2C）。由于在地上部分仍然存在At2g39530的mRNA。說明At2g39530可能是根部增強(qiáng)性表達(dá)的基因。

2.3 At2g39530的組織定位分析

構(gòu)建At2g39530的啟動(dòng)子融合GUS植物表達(dá)載體（見圖3A，此圖彩版見封三），轉(zhuǎn)化擬南芥，對(duì)篩選得到的純合體不同時(shí)期不同組織部位的GUS表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明GUS在根中表達(dá)量最高，進(jìn)一步對(duì)根進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)GUS在根尖不表達(dá)，而在下胚軸的基部有少量表達(dá)（見圖3B，此圖彩版見封三）。Real-time PCR數(shù)據(jù)分析及組織定位分析都表明At2g39530屬于根部增強(qiáng)性表達(dá)基因。

圖3 At2g39530的組織定位分析Fig.3 Tissue localization analysis of At2g39530

2.4 At2g39530的亞細(xì)胞定位分析

克隆終止子突變的At2g39530全長(zhǎng)序列并且將其插入到eGFP的上游，構(gòu)建好亞細(xì)胞定位載體（見圖4A，此圖彩版見封三）。通過基因槍轟擊洋蔥的方法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察At2g39530的亞細(xì)胞定位信號(hào)。結(jié)果表明，PBSK-eGFP空載體呈現(xiàn)遍在表達(dá)；PBSK-At2g39530-eGFP在細(xì)胞的表達(dá)模式與對(duì)照相比，主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（見圖4B，此圖彩版見封三）。說明At2g39530是一種在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的蛋白。

圖4 At2g39530的亞細(xì)胞定位分析Fig.4 Subcellular localization analysis of At2g39530

3 討論與結(jié)論

非生物脅迫（鹽、干旱、冷）都會(huì)嚴(yán)重威脅植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面，是造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)的主要原因。因此，對(duì)非生物脅迫及植物耐逆機(jī)制的研究成為近年研究熱點(diǎn)。UPF0497家族成員在非生物脅迫中的作用尚無研究。通過對(duì)家族成員啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)只有At2g39530和At2g03700具有DRE順式作用元件。通過對(duì)At2g39530和At2g03700的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，表明它們都對(duì)非生物脅迫具有響應(yīng)作用，Li等通過生物信息學(xué)的方法表明At2g39530可能對(duì)非生物脅迫具有響應(yīng)[14]。因此本試驗(yàn)選取At2g39530，研究UPF0497家族基因是否在非生物脅迫中具有作用。At2g39530不受ABA誘導(dǎo)，可能通過DRE元件以ABA非依賴方式對(duì)非生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。

UPF0497家族中5個(gè)成員與凱氏帶形成有關(guān)。At2g39530屬于根部增強(qiáng)性表達(dá)基因，但是根尖沒有表達(dá)，由于凱氏帶在遠(yuǎn)離根頂端位置的凱氏帶發(fā)育的更早[15]，說明At2g39530可能與凱氏帶的形成有關(guān)。大多數(shù)發(fā)育調(diào)控基因都表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)的特性[16]，At2g39530在根中的作用仍需深入研究。

本研究證明At2g39530對(duì)干旱、低溫和高鹽具有響應(yīng)作用，不響應(yīng)ABA，該結(jié)果為研究UPF0497家族成員在非生物脅迫中的作用奠定基礎(chǔ)。

At2g39530是一種根特異性表達(dá)并且在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)的蛋白，可能通過DRE元件以ABA非依賴方式對(duì)非生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。初步闡明了UPF0497家族成員在對(duì)非生物脅迫也具有響應(yīng)，但是非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制仍需深入研究。

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