馬紅英，楊明摯，張漢波，喬云倩，沙 濤＊＊

(1.云南大學(xué)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，云南 昆明 650091;2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091)

青頭菌又名綠菇 (Russula virescens)，隸屬于紅菇科(Russulacese)、紅菇屬 (Russula)，子實(shí)體大，食味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是常見菌類中最受人們歡迎的食用菌之一［1］。青頭菌是外生菌根真菌，與闊葉樹種及針葉樹種如云南松等形成外生菌根［2］。青頭菌中各種礦物元素和人體必需氨基酸的含量為0.58%，氨基酸總量為1.39%，必需氨基酸占總氨基酸的比值 (EAA/TAA)為41.8%，硒為每100克1.3 mg［3］。青頭菌子實(shí)體中所含的4種多糖為雜多塘，含有的單糖組分分別為木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及果糖，其中葡萄糖為主要單糖組分［4］。Zhong－wei Sun等報(bào)道青頭菌中含有可溶性粗多糖命名為RVP－1和RVP－2，其中RPV－1為較好的抗氧化劑［5］。

目前，青頭菌的研究報(bào)道不多，國(guó)內(nèi)主要集中在保鮮和化學(xué)成分分析方面。趙天瑞等［6］對(duì)青頭菌凍結(jié)工藝進(jìn)行了研究，湯建國(guó)等報(bào)道變綠紅菇化學(xué)成分研究分析結(jié)果［7］，孫忠偉等報(bào)道變綠紅菇子實(shí)體多糖的理化性質(zhì)及其抗腫瘤活性研究［4］，徐丹先等報(bào)道云南野生青頭菌的化學(xué)成分分析結(jié)果［3］。國(guó)外對(duì)青頭菌的報(bào)道主要集中于系統(tǒng)發(fā)育方面，澳大利亞Lebel和Tonkin報(bào)道經(jīng)ITS鑒定的紅菇科系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果［8］。歐洲Miller和Buyck對(duì)紅菇屬以下的種進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育分析，報(bào)道青頭菌與Russula mustelina親緣關(guān)系較近［9］。Shimon等通過對(duì)rDNA大亞基鑒定，紅菇科系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，青頭菌與紅菇屬Russula viridirubrobimbata親緣關(guān)系較近［10］。目前，人工馴化方面還未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，雖有報(bào)道青頭菌的菌絲體分離研究，但未見對(duì)其得到的菌絲體進(jìn)行鑒定。

對(duì)于食用菌的人工馴化，首先需要解決食用菌的菌種分離問題。食用菌菌種分離方法主要有孢子分離法、組織分離法和基內(nèi)菌絲分離法3種。其中組織分離法無菌操作技術(shù)要求較其他方法簡(jiǎn)便，因此組織分離法在實(shí)踐中被廣泛地應(yīng)用［11］。分離菌絲體的鑒定是后續(xù)研究的基礎(chǔ)，其中ITS(Internal Transcribed Spacer)是核糖體DNA中的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，目前被廣泛應(yīng)用于不同物種的系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)化和分類研究及菌種鑒定［12］，是真菌條形碼之一，在外生菌根真菌分離物的鑒定中也得到廣泛運(yùn)用。

本研究采用組織分離法對(duì)菌柄及菌蓋進(jìn)行分離，對(duì)ITS序列進(jìn)行鑒定。

1 材料及方法

1.1 供試菌種

青頭菌子實(shí)體，采于彌勒縣，編號(hào)為ML4。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基;MMN改良培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g(去皮，切片，煮沸20 min，用4層紗布過濾，取濾液)、葡萄糖5 g、麥芽糖2 g、酵母粉1 g、酒石酸銨0.25 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、氯化鈣 (1%)5 mL、氯化鈉 (1%)2.5 mL、氯化鐵 (1%)1.2 mL、瓊脂16 g，pH 5.5，蒸餾水1 000 mL;改良培養(yǎng)基:KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、麥芽糖5 g、酒石酸銨2 g、VB11 mL(40 μg·L－1)、瓊脂粉20 g，pH 6.0，水 1 000 mL。

3 方法

3.1 菌絲體的分離、純化

采用組織分離法，將預(yù)先配好的以上3培養(yǎng)基切成大小2 cm×2 cm的小塊，分裝于各平板中，每平板5塊，盡量留足夠的間隙。之后于無菌條件下用鑷子取已經(jīng)用酒消毒的新鮮子實(shí)體菌柄、菌蓋部位的組織，置于母種培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)。每處理5次重復(fù)，一級(jí)母種滿管后轉(zhuǎn)管2次。觀察菌絲的生長(zhǎng)速度及菌落形成情況。

3.2 DNA的提取、擴(kuò)增及鑒定

采用CTAB真菌DNA提取法［13］，將挑取的菌絲置于經(jīng)滅菌的1.5 mL干燥離心管，加入400 mL CTAB提取液，進(jìn)行研磨，研磨充分后加入200 mL CTAB提取液，65℃水浴1 h，再加入600 mL氯仿－三氯甲烷混合液，混合均勻后13 000 r·min－1離心10 min，收集上清液于新的1.5 mL離心管，之后重復(fù)以上操作2遍～3遍，直至上清液干凈。之后用等體積的三氯甲烷抽提，然后在抽提所得的上清液中加入0.5倍～1倍體積的異丙醇，4℃、13 000 r·min－1離心10 min。離心完畢后，棄上清液，將離心管倒扣于干凈的濾紙上直至吸光管上液體，之后用75%乙醇洗滌并離心2遍，倒扣于濾紙一夜，第2天加入40 μL去離子水。

采用通用引物 ITS4和 ITS5(ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC;ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)， 對(duì) 其ITS rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增［12］。擴(kuò)增體系總體積為50 μL，其中41.35 μL 去離子水，10 × PCR Buffer 5 μL，10 mmol·L－1dNTP 1 μL，10 μmol·L－1ITS4/ITS5 引物各0.6 μL，TaqDNA 酶0.25 μL，模板 DNA 1 μL(濃度 20 ng·μL－1～50 ng·μL－1)。PCR反應(yīng)條件:94℃反應(yīng)1 min，94℃反應(yīng)15 s，61℃反應(yīng)15 s，72℃反應(yīng)1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃反應(yīng)5 min。

測(cè)序反應(yīng)體系為:kit酶 2 μL，0.5 μmol·L－1ITS4/ITS5引物3 μL，PCR反應(yīng)產(chǎn)物1 μL。測(cè)序反應(yīng)條件為96℃反應(yīng)10 s，50℃反應(yīng)5 s，60℃反應(yīng)4 min，25個(gè)循環(huán)。

測(cè)序結(jié)果通過DNAStar、Chromas軟件校對(duì)，并在NCBI中BLAST比對(duì)下載已發(fā)表的＞96%的相似序列，相關(guān)序列用MEGA 4軟件經(jīng)CLUSTALW比對(duì)，剪切136 bp～834 bp位點(diǎn)序列，采用Jukes－Cantor模型構(gòu)建N－J樹。

2 結(jié)果

2.1 分菌統(tǒng)計(jì)結(jié)果

分別對(duì)5塊菌蓋及菌柄進(jìn)行分離，結(jié)果見表1。

表1 各培養(yǎng)基及各分離部位分離統(tǒng)計(jì)

從表1可以看出，PDA培養(yǎng)基分離成功數(shù)均為0，MMN改良培養(yǎng)基成功數(shù)為菌蓋成功數(shù)3，菌柄成功數(shù)4，改良培養(yǎng)基成功數(shù)分別為菌蓋成功數(shù)3，菌柄成功數(shù)4，因此MMN改良培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基。

2.2 形態(tài)觀察結(jié)果

分離物在25℃下培養(yǎng)50 d，形態(tài)觀察結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，菌落呈乳白色，圓形，菌絲致密，氣生菌絲不發(fā)達(dá)。

3 系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，青頭菌的多樣性較豐富，種內(nèi)差異較大。而本研究所分離的菌株ML4不與其他序列形成1支，遺傳差異較大。

4 討論

由于青頭菌是營(yíng)養(yǎng)共生型的外生菌根菌，必須供給其合適的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)條件才能使其孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)。在培養(yǎng)中菌絲生長(zhǎng)較慢且極易被污染，因此在分離過程中要嚴(yán)格地進(jìn)行消毒和無菌操作。本研究發(fā)現(xiàn)作為真菌分離常用的培養(yǎng)基PDA不能作為青頭菌分離的培養(yǎng)基，選用改良MMN培養(yǎng)基，對(duì)菌柄進(jìn)行分離為最佳分離方案，分離成功率達(dá)到80%，因此改良MMN培養(yǎng)基為菌種分離最佳培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)研究中由于青頭菌菌種菌絲生長(zhǎng)較慢，生長(zhǎng)2個(gè)月達(dá)到5 cm左右便停止生長(zhǎng)，因此要達(dá)到人工馴化的目的，還需進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化培養(yǎng)研究，尋找營(yíng)養(yǎng)足夠適合該菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。

外生菌根分離物是食用菌人工馴化的基礎(chǔ)，因此必須對(duì)菌種進(jìn)行科學(xué)鑒定。目前菌種鑒定，遺傳多樣性研究主要基于形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞水平、生化水平及分子水平得以開展［14］。而DNA作為遺傳物質(zhì)能客觀和真實(shí)地反映物種之間的親緣關(guān)系，對(duì)于菌種鑒定和系統(tǒng)分類是一種更有力的依據(jù)和補(bǔ)充。對(duì)比分離物及對(duì)應(yīng)子實(shí)體DNA指紋并結(jié)合分離菌株的形態(tài)特征來鑒別菌株是否屬于目的菌種的方法更趨科學(xué)和完善。因此，建議以后的研究利用分子方法對(duì)分離物進(jìn)行鑒定。

本研究還發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)所分離到菌種與其它地區(qū)的青頭菌有較大的遺傳差異性，而且青頭菌的種內(nèi)差異較大，生物多樣性較為豐富，而云南野生食用菌資源較為豐富，青頭菌分布較為廣泛。因此，下一步進(jìn)行云南野生青頭菌的系統(tǒng)發(fā)育研究是必要的。

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