魏 巍，余夢瑤，江 南，許曉燕，羅 霞

(四川省中醫(yī)藥科學院，四川 成都 610041)

猴頭菇Hericium erinaceus(Bull.er Fr.)Pers.，隸屬于擔子菌門 (Basidiomycota)、猴頭菌科 (Hericiaceae)真菌，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用真菌，因其形似猴頭，故稱“猴頭菇”，其味鮮美無比，營養(yǎng)豐富，是四大名菜之一，有“山珍猴頭、海味燕窩”之稱。除其營養(yǎng)豐富外，猴頭菇還有豐富的真菌多糖、猴頭菌素等生物活性成分［1］，中醫(yī)認為，猴頭菇性平味甘，具利五臟、助消化、滋補身體等功效，臨床上主要用于治療消化性潰瘍［2］、萎縮性胃炎［3］、肝炎以及胃癌的輔助治療［4］。據(jù)現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)猴頭菇還具有提高機體免疫、抗腫瘤等作用［5］。

通過研究發(fā)現(xiàn)，當猴頭菇子實體與其多糖提取物在一定比例上進行配比后的復方猴頭菇 (Compound Hericium erinaceus，CHE)，其免疫作用大大增強。對此，將通過藥理實驗對復方猴頭菇配方比例進行篩選，并對其免疫調節(jié)作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 猴頭菇與猴頭菇多糖提取物

猴頭菇產(chǎn)自四川省德陽市，洗凈烘干后，粉碎過100目篩。猴頭菇多糖提取物，按劉重芳等［6］使用方法制備，其中多糖以葡萄糖計，采用硫酸—蒽酮法測定含量為32%。

1.1.2 試劑

氫化可的松注射液，山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責任公司，國藥準字H14020980;注射用環(huán)磷酰胺 (CY)，山西泰盛制藥有限公司，國藥準字H14020373;RPMI－1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清、小牛血清購自Hyclone公司;MTT、ConA、LPS購自Sigma公司;印度墨汁購自 Chroma公司;LDH測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 動物與細胞株

動物:昆明種標準小鼠，體重18 g～22 g，雌雄各半，SPF級，合格證號為SCXK(川)2008－19。

細胞株:YAC－1細胞株 (小鼠淋巴瘤細胞株，ATCC編號:TIB－160)，購自中科院細胞所。

1.1.4 儀器

紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司，TU－1800;酶標儀，Thermo Multiskan Ascent;電子天平，Mettler Toledo AL104;細胞培養(yǎng)箱，Heraeus BB16UV等。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同配方的CHE對小鼠血清溶血素抗體生成的研究

小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，配方1、配方2、配方3中猴頭菇粉與多糖提取物的比例為10∶1、8∶1、6∶1(2 g·kg－1)，空白組和模型組給予同等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥30 d。在首次給藥后第23天，每只小鼠腹腔注射5%雞紅細胞溶液0.2 mL。在第23天、第25天、第27天，除正常組腹腔注射生理鹽水外，其余小鼠均腹腔注CY 20 mg·kg－1。末次給藥30 min后，從小鼠眼后靜脈叢取血20 μL，加入盛有1 mL生理鹽水的試管中，并加入4%雞紅細胞溶液0.5 mL，15%豚鼠血清0.5 mL，在37℃水浴中靜置1 h后，放入冰水中終止反應10 min，2 000 r·min－1離心10 min，取上清液1 mL，加入3 mL臨時配制的血紅蛋白應用液中，于540 nm處比色［7］。

1.2.2 不同配方的CHE對小鼠遲發(fā)型超敏反應 (DTH)的研究

動物分組與給藥同1.2.1。首次給藥后第24天小鼠腹部去毛部位用25 μL·只－1的1%DNFB－丙酮溶液致敏，第26天同法同一部位強化1次，除正常組腹腔注射生理鹽水外，其余小鼠在第24天、第26天、第28天腹腔注射CY 50 mg·kg－1，第29天在小鼠右耳涂以1%DNFB－丙酮食用油 (v∶v=3∶7)溶液10 μL，24 h后將小鼠處死，剪耳朵于電子天平稱取左右耳。以左耳與右耳的差值 (mg)和腫脹度作為小鼠DTH 反應強度［8］。

1.2.3 CHE對小鼠血清溶血素抗體生成的研究

小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，其中高劑量組、中劑量組和低劑量組每組分別經(jīng)口給予復方猴頭菇粉0.5 g·kg－1、1 g·kg－1、2 g·kg－1，實驗方法同 1.2.1。

1.2.4 CHE對小鼠遲發(fā)型超敏反應的研究

動物分組與給藥同1.2.3，實驗方法同1.2.2。

1.2.5 CHE對小鼠碳粒廓清能力的研究

動物分組與給藥同1.2.3。給藥后第23天～第29天，除正常組皮下注射生理鹽水外，其余小鼠均皮下注射氫化可的松25 mg·kg－1。給藥后第30天，小鼠灌胃30 min后，小鼠按0.1 mL/10 g體重尾靜脈注射以1%明膠配制的25%印度墨汁。于注射后30 s和6 min分別在小鼠眼后靜脈叢用尖嘴吸管取血20 μL，加入盛有0.1%Na2CO32 mL溶液的試管中，搖勻后于675 nm處分別測定2次吸光值。迅速脫頸處死動物，稱量肝、脾重量。按公式計算吞噬指數(shù)K和校正吞噬指數(shù)α，公式為［9］:

K=(lgOD1－lgOD2)/(T1－T2)，α =K1/3·W/WLS

式中:OD為吸光度;T為時間;W為體重;WLS為肝脾合重。

1.2.6 CHE對小鼠脾淋巴細胞增殖的研究

小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，高劑量組、中劑量組和低劑量組每組分別經(jīng)口給予復方猴頭菇粉0.5 g·kg－1、1 g·kg－1、2 g·kg－1，空白組和模型組給予同等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥30 d后脫頸處死，無菌取脾。以注射器芯在200目鋼絲網(wǎng)上輕輕將脾磨碎，并滴加適量RPMI－1640培養(yǎng)液洗下細胞。收集細胞液，并加入等量0.83%Tris－NH4Cl溶液，靜置5 min破壞紅細胞。1 500 r·min 離心10 min收集細胞，以10%胎牛血清RPMI－1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，臺盼藍染色計數(shù) (活細胞數(shù)應＞95%)。96孔板每孔加入1×106個細胞，每孔總體積為200 μL。每個樣品各設9個復孔，其中3孔加入1 mg·mL－1ConA約2 μL，另3孔加入1 mg·mL－1LPS 2 μL，其余3孔不做處理。細胞培養(yǎng)板置37℃、5%CO2飽和濕度空氣條件下培養(yǎng)3 d，于培養(yǎng)結束前4 h取出，從每孔中吸出 100 μL上清液，再加入 10 μL、5 mg·mL－1MTT，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，每孔加10%SDS(用 0.01 mol·L－1的 HCl配制)100 μL，37℃ 下放置 4 h。振蕩混勻，使結晶物充分溶解。在570 nm波長處用酶標儀測定每孔 OD 值［10］。

1.2.7 CHE對小鼠NK細胞活性的研究

動物分組、給藥、配置單細胞懸液同1.2.6。配置好的單細胞懸液為效應細胞。取對數(shù)生長期的YAC－1細胞，離心收集細胞，并以10%胎牛血清RPMI－1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，臺盼藍染色計數(shù) (活細胞數(shù)應＞95%)，此即為備用的靶細胞。在96孔板中，每孔加入效應細胞2×106個，靶細胞4×104個 (效靶比=50∶1)，每孔總體積為200 μL，每個樣品設3個復孔。另設僅含靶細胞的靶細胞自然釋放孔和僅含效應細胞的效應細胞自然釋放孔，以及僅含靶細胞但培養(yǎng)液中含終濃度為1.25%Triton X－100的最大釋放孔。細胞板1 000 r·min－1離心5 min，以使靶細胞和效應細胞充分接觸。細胞培養(yǎng)板置37℃、5%CO2飽和濕度空氣條件下培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后，吸取培養(yǎng)上清液100 μL，采用LDH測定試劑盒測定其中LDH含量。NK細胞殺傷率 (P)公式［11］為:

P=(OD1－ OD2－OD3)×100%/(OD4－ OD3)。式中:OD1為藥物組OD值;OD2為效應細胞自然釋放OD值;OD3為靶細胞自然釋放OD值;OD4為最大釋放OD值。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用方差分析進行組間差異比較。

2 結果與分析

2.1 不同配方的CHE對小鼠血清溶血素抗體生成的影響

不同配方的CHE對小鼠血清溶血素抗體生成的影響見表1。

表1 CHE對小鼠血清溶血素抗體生成的影響

由表1可見，CY(20 mg·kg－1)使小鼠血清溶血素水平明顯降低 (p＜0.01)。而灌胃不同配方的CHE后，血清溶血素抗體生成水平明顯提高，其中比例2和比例3提高最為顯著 (與模型組比較p＜0.01)，分別提高81%和85%。

2.2 不同配方的CHE對小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響

不同配方的CHE對小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響見表2。

表2 猴頭菇復方對小鼠皮膚遲發(fā)型變態(tài)反應的影響

由表2可見，注射CY(50 mg·kg－1)，由DNFB引起的DTH明顯減弱，模型組小鼠耳重差與腫脹度明顯降低 (p＜0.01)。灌胃不同比例的復方猴頭菇后，小鼠耳重差與腫脹度均明顯提高，其中比例2和比例3提高最為顯著 (與模型組比較p＜0.01)。

2.2.3 CHE對小鼠血清溶血素抗體生成的影響

CHE對小鼠血清溶血素抗體生成的影響見表3。

表3 CHE對小鼠血清溶血素抗體生成的影響

由表3可見，而灌胃CHE 30 d后，血清溶血素抗體生成水平明顯提高，與模型組相比具有顯著差異 (低劑量、中劑量p＜0.05，高劑量p＜0.01)并呈劑量關系。

2.2.4 CHE對小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響

CHE對小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響見表4。

表4 CHE對小鼠皮膚遲發(fā)型變態(tài)反應的影響

由表4可見，灌胃CHE 30 d后，小鼠耳重差與腫脹度明顯提高，并呈劑量關系，給藥組耳重差與腫脹度與模型組比較有顯著差異 (低劑量p＜0.05，中劑量和高劑量p＜0.01)。

2.2.5 CHE對小鼠碳粒廓清能力的影響

CHE對小鼠碳粒廓清能力的影響見表5。

表5 CHE對小鼠碳粒廓清能力的影響

由表5可見，注射氫化可的松后 (25 mg·kg－1)，模型組碳粒廓清能力顯降低，與空白組比較有顯著性差異 (p＜0.01)。灌胃CHE 30 d后，小鼠碳粒廓清能力有明顯提高，并呈劑量關系，中劑量組和高劑量組吞噬指數(shù)K和校正吞噬系數(shù)α與模型組比較有顯著差異 (p＜0.05)。

2.2.6 CHE對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

CHE對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響見圖1。

由圖1可知，在未加入誘導劑條件下，CHE并不能增加小鼠脾淋巴細胞的增殖能力。但在T細胞絲裂原ConA或B細胞絲裂原LPS誘導下，CHE能夠提高小鼠脾淋巴細胞的增殖能力，并呈劑量關系，中劑量組在ConA誘導下能顯著增加小鼠脾淋巴細胞的增殖能力 (p＜0.05)，高劑量組在ConA或LPS誘導下能顯著增加小鼠脾淋巴細胞的增殖能力 (p＜0.05)。

2.2.7 CHE對小鼠NK細胞活性的影響

CHE對小鼠NK細胞活性的影響見表6。

表6 CHE對小鼠NK細胞活性的影響

由表6可見，灌胃CHE 30 d后，小鼠NK細胞活性明顯提高，并呈劑量關系，中劑量組和高劑量組NK細胞殺傷率與空白組比較有顯著差異 (p＜0.05)。

3 討論

通過小鼠血清溶血素抗體生成和小鼠遲發(fā)型超敏反應，對猴頭菇粉與猴頭菇多糖提取物的搭配比例進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)當猴頭菇粉與猴頭菇多糖提取物達到8∶1時小鼠免疫功能提高最明顯，但是再提高猴頭菇多糖的含量，其免疫功能未有明顯提高，因此選擇比例2作為后續(xù)研究。本研究發(fā)現(xiàn)CHE在1 g·kg－1劑量下就能明顯地增加小鼠溶血素的生成、提高小鼠遲發(fā)型超敏反應能力、加快單核巨噬細胞迅速度、刺激B細胞和T細胞的增殖能力和NK細胞的活性，能明顯提高小鼠的免疫功能，并呈劑量關系。

以真菌自身與自身提取物或是以不同部位的提取作為搭配進行藥理研究的報道較少，這種“配伍”方式主要在一些藥用菌的藥品和保健品中使用，例如據(jù)報道以靈芝孢子粉與靈芝提取物為主要成分的復方靈芝膠囊能提高小鼠免疫功能［12］，對S180肉瘤細胞、H22肝癌細胞與Lewis肺癌細胞生長均具有一定的抑制作用，并能增強環(huán)磷酰胺和5－氟尿嘧啶對S180肉瘤細胞的殺傷作用［13］。另外有研究表明猴頭菇多糖、香菇多糖、茯苓多糖通過一定的搭配比例后組對荷瘤動物的腫瘤均有明顯的抑制作用，作用效果明顯優(yōu)于香菇多糖［14，15］。這提示我們，在藥用真菌中所表現(xiàn)生物活性的物質有多種，當這些活性物質在一個正確的比例時，就像中藥復方，能明顯的增強所表現(xiàn)的生物活性，這為藥用真菌的開發(fā)提供了一個新的思路。

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