高偉忠， 但 伶， 田澤丹， 張 殷， 黃 燕

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，重慶400010)

肝臟缺血再灌注(ischemia reperfusion)損傷是肝臟外科常見的病理生理過程，在中央型肝腫瘤及肝移植手術(shù)中常采取結(jié)扎肝蒂的方法來阻斷肝血流以減少術(shù)中出血，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)血供恢復(fù)后不僅可引起肝臟原發(fā)功能低下，還因為炎性因子和凋亡因子的釋放、鈣超載及自由基的產(chǎn)生等引起再灌注損傷，導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官如腦、肺、心臟等的功能受損［1］。

丙泊酚(propofol)是一種常用的靜脈麻醉藥，研究發(fā)現(xiàn)其能通過滅活氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化及抗炎在缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用［2］;研究還發(fā)現(xiàn)丙泊酚在肝缺血再灌注所致的心腦損傷中可通過磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路發(fā)揮保護(hù)作用［3-4］。丙泊酚能否通過PI3K/Akt信號通路在肝缺血再灌注所致的肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，尚未見報道。本實驗擬建立大鼠肝缺血再灌注肺損傷模型，通過觀察丙泊酚對大鼠全肝缺血再灌注肺損傷PI3K/Akt信號通路活化的影響，來探討丙泊酚在全肝缺血再灌注肺損傷中的作用機(jī)制。

材料和方法

1 動物與試劑

清潔級SD大鼠66只，雌雄不限，體重250～280 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)中心提供。兔抗鼠Akt多克隆抗體、兔抗鼠p-Akt多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體和兔抗鼠 β-actin單克隆抗體(Bioworld)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD)，1% 丙泊酚注射液 (Astra Zeneca)，PI3K阻斷劑wortmannin(Proteintech)。

2 實驗分組和模型制備

大鼠隨機(jī)分成4組，假手術(shù)組(S組，n=6)、肝缺血再灌注組(IR組，n=24)、丙泊酚組(P組，n=24)和丙泊酚+PI3K阻斷劑wortmannin組(P+W組，n=12)，IR 組和 P 組按再灌注 1 h、3 h、6 h、12 h分為4個亞組，P+W 組按再灌注3 h、6 h分為2個亞組。參照 Pringle's等［5］建立全肝缺血再灌注模型，術(shù)前大鼠禁食12 h，自由飲水，10%水合氯醛4 mL/kg行腹腔注射麻醉，S組僅解剖肝門，不結(jié)扎;IR組采用結(jié)扎肝蒂全肝缺血30 min，再灌注的方法建立大鼠肝缺血再灌注模型;P組缺血前10 min經(jīng)尾靜脈緩慢注射負(fù)荷劑量的丙泊酚20 mg·kg－1，再以20 mg·kg－1·h－1的速度尾靜脈泵注直至處死，余同IR組;P+W組缺血前經(jīng)尾靜脈注射 PI3K阻斷劑Wortmannin 15 μg·kg－1［6］，余同 P 組。

3 標(biāo)本采集

S組于分離肝門后1 h時、IR組和 P組于再灌注 1 h、3 h、6 h、12 h 時、P+W 組于再灌注 3 h、6 h時處死大鼠，開胸迅速取右肺組織行細(xì)胞凋亡檢測;左肺取部分肺組織置于－80℃冰箱低溫保存，用Western blotting檢測蛋白變化，剩余肺組織用10%多聚甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察病理變化。

4 指標(biāo)測定

4.1 Western blotting測定各組肺組織總 Akt(t-Akt)、磷酸化 Akt(p-Akt)和 Bcl-2蛋白的表達(dá)從－80℃冰箱中取出肺組織，用液氮研磨至粉末，加蛋白裂解液裂解30 min后，4℃ 15 000 r/min離心15 min，取上清液，Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度，分裝于－80℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白上樣量進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5% 的脫脂奶粉室溫封閉1 h，Ⅰ抗(兔抗鼠 anti-t-Akt、anti-p-Akt和 anti-Bcl-2多克隆抗體1∶1 500)過夜，Ⅱ抗(HRP 標(biāo)記山羊抗兔抗體1∶20 000)37℃ 反應(yīng)1 h，并以兔抗鼠β-actin(1∶500)單克隆抗體同上操作，作為上樣對照。加入ECL(Pierce)化學(xué)發(fā)光試劑，Bio-Rad凝膠成像儀顯影成像，Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白條帶的灰度值測定，以反映 t-Akt、p-Akt和 Bcl-2蛋白的表達(dá) 。

4.2 Annexin V-FITC/PI熒光雙染色法檢測肺細(xì)胞凋亡 新鮮肺組織用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，剪碎，300目銅網(wǎng)過濾制成細(xì)胞懸液，調(diào)整各管的細(xì)胞數(shù)約為1×109/L，再取肺細(xì)胞(2～5)×105個，以PBS液清洗，500 r/min離心1 min，沉淀肺細(xì)胞，棄去上清液，加入結(jié)合緩沖液195 μL，懸浮肺細(xì)胞，加入Annexin V 5 μL，混勻后避光放置 10 min，然后 PBS液清洗，500 r/min離心 1 min，沉淀肺細(xì)胞，以 190 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶(PI)，混勻后上機(jī)，行流式細(xì)胞術(shù)檢測，用CellQuest Pro軟件分析細(xì)胞凋亡率［7］。以Annexin V為橫軸，PI為縱軸:其中左上象限為機(jī)械性損傷細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，左下象限為正常細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞。

4.3 HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化 肺組織用10% 多聚甲醛固定、石蠟包埋切片后行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺組織t-Akt、p-Akt及Bcl-2蛋白表達(dá)

與S組比較，IR組、P組和P+W組肺組織中p-Akt和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平升高(P＜0.05);與 IR組比較，P組p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05)，P+W 組 p-Akt和 Bcl-2蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與 P組比較，P+W 組 p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降(P＜0.05);各組中t-Akt蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1～3和表1。

Figure 1.Expression of t-Akt protein in lung tissues 3 h after hepatic ischemia reperfusion in each group detected by Western blotting.圖1 肝缺血再灌注3 h肺組織t-Akt的表達(dá)

Figure 2.Expression of p-Akt protein in lung tissues 1，3，6 and 12 h after hepatic ischemia reperfusion in each group detected by Western blotting.圖2 肝缺血再灌注1、3、6和12 h肺組織p-Akt的表達(dá)

Figure 3.Expression of Bcl-2 protein in lung tissues 1，3，6 and 12 h after hepatic ischemia reperfusion in each group detected by Western blotting.圖3 肝缺血再灌注1、3、6和12 h肺組織Bcl-2的表達(dá)

表1 不同時點t-Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平Table 1.Expression of t-Akt，p-Akt and Bcl-2 proteins in lung tissues at different time points(mean±SD.n=6)

2 肺組織細(xì)胞凋亡情況

與S組比較，IR組、P組和P+W組肺細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05)，再灌注3 h時肺細(xì)胞凋亡率最高;與 IR組比較，P組肺細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.05)，P+W組肺細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與 P組比較，P+W 組肺細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05)，見圖4和表2。

Figure 4.Representative results of lung cell apoptotic rate in all groups.A:S group;B:IR group;C:P group;D:P+W group.圖4 各組肺細(xì)胞凋亡情況比較

表2 不同時點肺細(xì)胞凋亡率的比較Table 2.Apoptotic rates of lung cells induced by hepatic ischemia reperfusion at different time points(mean±SD.n=6)

3 肺組織病理學(xué)改變

S組肺組織結(jié)構(gòu)正常;IR組肺間質(zhì)水腫，肺泡壁破壞，肺泡內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤伴出血，尤以再灌注6 h時明顯，P組肺組織損傷較IR組輕，肺泡壁增寬，肺泡腔出血較少，偶見炎癥細(xì)胞;而P+W組肺組織損傷較P組重，和IR組無明顯差別，見圖5。

Figure 5.The lung tissue pathological changes(HE staining，×200).A:S group;B:IR group;C:P group;D:P+W group.圖5 各組肺組織病理學(xué)變化

討 論

本研究參照 Pringle's法，通過結(jié)扎大鼠肝蒂的方法來建立肝缺血再灌注肺損傷模型，大鼠肝缺血再灌注后光鏡下見肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔出血，檢測肺細(xì)胞凋亡率升高，提示大鼠肝缺血再灌注肺損傷模型制備成功。根據(jù)預(yù)實驗再灌注3 h時肺細(xì)胞凋亡率最高，6 h時肺組織病理學(xué)損傷最重，故P+W組取再灌注3 h和6 h時檢測相關(guān)指標(biāo)。

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的程序性、主動性細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為凋亡基因的表達(dá)和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，PI3K/Akt信號通路是近年來研究的一條重要的抗凋亡信號通路，PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，當(dāng)受到來自G蛋白偶聯(lián)受體或酪氨酸激酶的信號后，PI3K的p110亞基與 p85亞基結(jié)合而活化Akt，激活的 Akt能夠向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運，并與相應(yīng)部位的底物蛋白發(fā)生作用，使底物蛋白特定部位的絲、蘇氨酸磷酸化形成 p-Akt，p-Akt通過對下游因子bcl-2、bad及 bax等的調(diào)節(jié)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生存的調(diào)控作用［8-9］。其中，bcl-2是抗凋亡家族中最重要的抗凋亡基因，研究發(fā)現(xiàn)其編碼的Bcl-2蛋白通過阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放、對抗脂質(zhì)過氧化及減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載等發(fā)揮抗損傷和抑制細(xì)胞凋亡的作用［3，10］;研究還發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白能通過阻止線粒體內(nèi)細(xì)胞色素 C的釋放、抑制caspase-3的激活來抑制細(xì)胞凋亡［11］。

本研究中P組較IR組p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平增高，肺細(xì)胞凋亡率降低，肺組織病理學(xué)損傷減輕，說明丙泊酚對大鼠肝缺血再灌注誘發(fā)的肺損傷有抑制作用，這與 Wang等［4］的研究結(jié)果丙泊酚能通過PI3K/Akt信號通路抑制組織缺血再灌注后細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)組織器官相一致;P+W組在使用特異性阻斷劑 wortmannin阻斷 PI3K/Akt信號通路后，p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯下降，肺細(xì)胞凋亡率增高，肺組織病理學(xué)損傷加重，說明P+W組丙泊酚的保護(hù)作用減弱;進(jìn)而說明丙泊酚減輕大鼠肝缺血再灌注誘發(fā)的肺損傷與 PI3K/Akt信號通路激活，上調(diào) p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)肺細(xì)胞凋亡有關(guān)，而使用PI3K特異性阻斷劑阻斷PI3K/Akt信號通路則丙泊酚的保護(hù)作用被抑制。

丙泊酚作為烷基酚類的短效靜脈麻醉藥因具有麻醉誘導(dǎo)起效快、蘇醒迅速且功能恢復(fù)完善的特點而廣泛應(yīng)用于臨床，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以抑制 AIF和 p38 MAPK信號通路的激活，下調(diào)NF-κB和iNOS的表達(dá)，從而減少炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)保護(hù)組織器官［12-13］;研究還發(fā)現(xiàn)丙泊酚能通過滅活氧自由基和減輕鈣超載的作用減輕缺血再灌注對機(jī)體的損傷［2，14-15］。最新研究認(rèn)為丙泊酚的藥理機(jī)制是通過激活 GABA(γ-氨基丁酸)受體，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠作用，大劑量時使 GABA受體脫敏感，從而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠效應(yīng)，作為GABA受體之一的GABAB受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，當(dāng)GABAB受體受到刺激激活后，可通過G蛋白偶聯(lián)受體信號活化 PI3K，從而激活 PI3K/Akt信號通路，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)［16-18］。

綜上所述，我們得出丙泊酚可以減輕大鼠肝缺血再灌注誘發(fā)的肺損傷，該作用與PI3K/Akt信號通路的激活進(jìn)而下調(diào)細(xì)胞凋亡有關(guān)，通過對丙泊酚作用機(jī)制的深入研究，可能為臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

［1］ Miranda LE，Capellini VK，Reis GS，et al.Effects of partial liver ischemia followed by global liver reperfusion on the remote tissue expression of nitric oxide synthase:lungs and kidneys［J］.Transplant Proc，2010，42(5):1557-1562.

［2］ Yuzbasioglu MF，Aykas A，Kurutas EB，et al.Protective effects of propofol against ischemia reperfusion injury in rat kidneys［J］.Ren Fail，2010，32(5):578-583.

［3］ 蘆 濱，趙建力，牛栓成，等.異丙酚對肝缺血再灌注大鼠心肌損傷的影響及PI3K/Akt信號通路在其中的作用［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2010，30(10):1250-1253.

［4］ Wang HY，Wang GL，Yu YH，et al.The role of phosphpinositide-3-kinase/Akt pathway in propofol-induced postconditioning against focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Brain Res，2009，1297:177-184.

［5］ Maehara S，Adachi E，Shimada M，et al.Clinical usefulness of biliary scope for Pringle's maneuver in laparoscopic hepatectomy［J］.J Am Coll Surg，2007，205(6):816-818.

［6］ Wang Y，Ahmad N，Wang B，et al.Chronic preconditioning:a novel approach for cardiac protection ［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(5):H2300-H2304.

［7］ 陸遠(yuǎn)強(qiáng)，黃衛(wèi)東，顧琳慧，等.高滲氯化鈉溶液復(fù)蘇抑制失血性休克大鼠肺細(xì)胞凋亡的初步研究［J］.中華危重癥醫(yī)學(xué)雜志:電子版，2008，1(2):79-83.

［8］ Wang B，Shravah J，Luo H，et al.Propofol protects against hydrogen peroxide-induced injury in cardiac H9c2 cells via Akt activation and Bcl-2 up-regulation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，389(1):105-111.

［9］ Song JQ，Teng X，Cai Y，et al.Activation of Akt/GSK-3β signaling pathway is involved in intermedin1-53protection against myocardial apoptosis induced by ischemia/reperfusion［J］.Apoptosis，2009，14(11):1299-1306.

［10］ 祝海洲，詹自力，何衛(wèi)陽，等.地塞米松和川芎嗪對腎缺血再灌注時c-Fos、Bcl-2、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響［J］.中國病理生理雜志，2004，20(5):893-895.

［11］ Park SE，Park C，Kim SH，et al.Korean red ginseng extract induces apoptosis and decreases telomerase activity in human leukemia cells［J］.J Ethnopharmacol，2009，121(2):304-312.

［12］ 鄧必高，但 伶，曹慧靈.異丙酚對大鼠內(nèi)毒素腦損傷AIF表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(4):746-750.

［13］ 曹慧靈，但 伶，鄧必高.異丙酚抑制脂多糖致大鼠腦損傷時p38 MAPK的活化［J］.中國病理生理雜志，2011，27(8):1639-1642.

［14］ Jin YC，Kim W，Ha YM，et al.Propofol limits rat myocardial ischemia and reperfusion injury with an associated reduction in apoptotic cell death in vivo［J］.Vasc Pharmacol，2009，50(1-2):71-77.

［15］ 楊 舜，裴 淩.異丙酚和氯胺酮減輕大鼠腎缺血再灌注損傷［J］.中國病理生理雜志，2010，26(1):177-180.

［16］ Stewart DS，Savechenkov PY，Dostalova Z，et al.p-(4-Azipentyl)propofol:a potent photoreactive general anesthetic derivative of propofol［J］.J Med Chem，2011，54(23):8124-8135.

［17］ Leon I，Cocinero EJ，Millán J，et al.Exploring microsolvation of the anesthetic propofol［J］.Phys Chem Chen Phys，2012，14(13):4398-4409.

［18］ Yang B，Wang BF，Lai MJ，et al.Differential involvement of GABAAand GABABreceptors in propofol self-administration in rats［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32(12):1460-1465.