洪芬芳， 張大雷， 涂桂林， 郭發(fā)先， 楊樹(shù)龍△

(南昌大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，2醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，江西南昌330006)

肝臟缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷是一個(gè)重大臨床問(wèn)題［1-2］，在創(chuàng)傷、熱損傷、血容量減少、內(nèi)毒素休克、重建血管外科、肝移植和肝腫瘤切除外科手術(shù)中均存在I/R損傷［3］。白三烯(leukotrienes，LTs)是經(jīng) 5-脂氧化酶(5-lipoxygenase，5-LO)途徑產(chǎn)生的一類(lèi)重要前炎癥花生四烯酸類(lèi)物質(zhì)。LTs包括半胱氨酰白三烯 (cysteinyl leukotrienes，Cys-LTs;包括LTC4、LTD4和LTE4)以及白三烯 B4(LTB4)。Cys-LTs母體復(fù)合物L(fēng)TC4由肝微粒體白三烯C4合酶(leukotriene C4 synthase，LTC4S)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(microsomal glutathione S-transferase，mGST)2和mGST3催化LTA4和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)結(jié)合而成［4-5］。不斷增加的證據(jù)提示肝臟I/R損傷病理機(jī)制中涉及LTs［3］。我們的結(jié)果［3］也顯示肝臟I/R早期LTC4產(chǎn)物增加可能與膜脂質(zhì)過(guò)氧化以及肝臟功能和形態(tài)組織損傷使LTC4代謝產(chǎn)物的排泄減少有關(guān)，而LTC4的積聚可能加重肝臟I/R損傷導(dǎo)致的業(yè)已存在的炎癥損傷。缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IP)是指肝臟短暫缺血事件能對(duì)隨后的長(zhǎng)時(shí)間I/R損傷產(chǎn)生保護(hù)并提高其再生能力［6］。一系列證據(jù)表明IP在肝移植等涉及I/R損傷過(guò)程中具有保護(hù)作用［7-8］。但存在一些矛盾的報(bào)道［9-10］，且IP減輕肝臟I/R的機(jī)制尚未完全闡明［7］。至今未見(jiàn)有關(guān)IP減弱大鼠肝I/R損傷會(huì)否涉及LTC4生成的研究報(bào)道。

材料和方法

1 材料

雄性SD大鼠(250～300 g)18只，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。LTC4和前列腺素B2(prostaglandin，PGB2)均購(gòu)自Cayman。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspertate aminotransferase，AST)活性和肝組織GSH檢測(cè)試劑盒系南京建成公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 肝I/R損傷動(dòng)物模型建立 成年雄性SD大鼠18只(平均每組6只)，隨機(jī)分為以下3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)肝臟I/R組:按文獻(xiàn)［3］所述采用 Pringle’s操作方法制作大鼠肝臟I/R損傷模型。戊巴比妥鈉40 mg/kg ip麻醉后固定，無(wú)菌條件下使用內(nèi)徑0.9 mm聚乙烯管行頸靜脈插管以便抽血和補(bǔ)液，腹部正中切開(kāi)，用無(wú)創(chuàng)傷動(dòng)脈夾夾閉供應(yīng)肝左、中葉的動(dòng)靜脈60 min再灌流5 h制成I/R損傷模型;再灌注5 h處死動(dòng)物，采血并速取肝左葉置液氮中凍存并轉(zhuǎn)至-80℃冰箱儲(chǔ)存以備檢測(cè)，取0.5 g肝組織加4.5 mL生理鹽水勻漿離心并保存-80℃待測(cè)，另取肝中葉組織制備肝微粒體和少量組織用甲醛緩沖液固定做免疫組化或蘇木精和曙紅染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。(2)假手術(shù)對(duì)照組:只麻醉開(kāi)腹，不阻斷肝臟血流。(3)IP組:以短暫10 min缺血再灌注10 min作為IP處理，之后開(kāi)始較長(zhǎng)時(shí)間60 min缺血和5 h再灌注。

2.2 肝組織LTC4含量的檢測(cè) 按文獻(xiàn)［3］，采用反相高效液相色譜法(reversed-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組肝組織中LTC4含量。

2.3 血清ALT、AST活性和肝組織GSH含量檢查使用試劑盒，根據(jù)制造商的說(shuō)明采用分光光度計(jì)測(cè)定血清ALT和AST的活性和肝組織中GSH含量。

2.4 組織學(xué)檢查 在室溫用10%甲醛固定肝臟組織，石蠟包埋，制作5 mm的切片，用蘇木精伊紅染色，光鏡下檢查肝臟組織結(jié)構(gòu)損傷情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析。組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IP對(duì)肝臟I/R期間LTC4含量的影響

與對(duì)照組相比，I/R組肝組織中LTC4含量顯著增加(P＜0.01)，IP組未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05);而與I/R組相比，IP組肝臟LTC4水平顯著降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

2 IP對(duì)大鼠肝I/R損傷期間血清ALT和AST活性以及肝組織GSH含量的影響

如表1所示，I/R和IP組血清ALT和AST值均高于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。與I/R組相比，IP顯著降低血清ALT和AST水平(P＜0.01或P＜0.05)。I/R組中肝組織GSH含量低于對(duì)照組(P＜0.05)，與I/R組相比，IP處理增加肝組織GSH含量(P ＜0.05)。

3 病理檢查結(jié)果

再灌注5 h后肝臟可見(jiàn)明顯結(jié)構(gòu)損傷和局灶性壞死，IP組僅有較小結(jié)構(gòu)損傷，對(duì)照組顯示正常的肝組織結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖2。

討 論

Figure 1.HPLC chromatograms demonstrating LTC4 content in rat liver tissues.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control;##P＜0.01 vs I/R.圖1 各組大鼠肝組織LTC4含量的變化

I/R損傷被認(rèn)為參與了肝切除術(shù)或移植后肝功能衰竭的發(fā)病機(jī)制，可能引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征。大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，IP在防止肝I/R損傷發(fā)展方面有較好的作用。但I(xiàn)P減輕肝I/R損傷的確切機(jī)制仍未完全闡明。進(jìn)一步了解IP保護(hù)機(jī)制，將促進(jìn)其在肝移植等治療方面的應(yīng)用，加速I(mǎi)/R肝損傷替代治療。

LTs是作用廣泛的炎癥介質(zhì)，參與了多種肝功能和肝臟疾病的生理和免疫反應(yīng)。不斷增加的證據(jù)表明 LTs涉及肝 I/R 損傷的病理生理機(jī)制［3，11-12］，尚缺少肝I/R損傷期間IP關(guān)聯(lián)LTs的報(bào)道，包括IP對(duì)LTC4S蛋白表達(dá)、LTC4合成酶的活性，以及LTC4生成的影響。本實(shí)驗(yàn)中I/R大鼠肝組織中LTC4生成增加，與以前的報(bào)道一致［3，11］，此外，我們首先發(fā)現(xiàn)，IP處理顯著減少I(mǎi)/R損傷肝臟LTC4生成，可能是IP防治肝臟I/R損傷的原因之一。

表1 對(duì)照組、I/R和IP組大鼠血清ALT和AST活性以及肝組織GSH含量的變化Table 1.Changes of serum ALT and AST activity and liver GSH level in rats of control，I/R and IP groups(mean±SD.n=6)

Figure 2.Rat liver histological changes in control(A)，I/R(B)and IP(C)groups after 5 h of reperfusion following 60 min of hepatic ischemia(HE staining，×200).圖2 對(duì)照組、I/R和IP組大鼠肝I/R損傷早期組織形態(tài)學(xué)的變化

已知肝臟是參與系統(tǒng)起源的花生四烯酸產(chǎn)物降解和消除的一個(gè)主要器官［13］，Cys-LTs和LTB4均在肝臟經(jīng)ω-氧化和β-氧化降解，此降解途徑在肝硬化和肝腎綜合征時(shí)發(fā)生了改變［11，14］。研究表明［3，15］，在病理?xiàng)l件下LTs生成增加，可參與對(duì)肝細(xì)胞直接損傷。本研究中，盡管與對(duì)照組相比，IP處理增加了血清ALT和AST的活性，但這些值在IP組均明顯低于I/R組。同時(shí)，I/R損傷大鼠存在肝結(jié)構(gòu)損傷和一些壞死，而IP減弱了I/R造成的肝損傷。此外，I/R降低而IP增加了肝組織GSH水平。這些結(jié)果顯示，IP處理可以明顯改善再灌注早期肝功能和結(jié)構(gòu)，并抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，表明IP可能部分通過(guò)改善I/R損傷大鼠肝臟分泌排泄LTC4的功能，減少LTC4堆積，保護(hù)I/R損傷的肝臟。

總之，我們的研究結(jié)果表明，在大鼠肝缺血60 min再灌注5 h后，IP減少了肝LTC4生成，同時(shí)伴隨有肝酶釋放減少和肝組織結(jié)構(gòu)改善，以及氧化應(yīng)激反應(yīng)的降低，表明IP降低LTC4生成可能涉及其在肝臟I/R期間的保護(hù)作用機(jī)制。本研究將進(jìn)一步加深對(duì)IP誘導(dǎo)器官耐受性的理解，并推動(dòng)其在肝移植治療中的應(yīng)用。

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