方 勇， 侯 琦， 盧 瑜

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，附屬邵逸夫醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州310016;2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所，北京100050;3南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院療養(yǎng)二科，浙江 杭州310007)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤［1］，無論是發(fā)病率還是死亡率均占首位，近年來發(fā)病率呈增長趨勢［2］。而浸潤性膀胱癌常出現(xiàn)威脅生命的遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，患者幾乎100%死亡。因此如果能尋找到一種天然化合物，可抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而降低死亡率，這將具有極其重要的臨床意義［3］。

近年來的研究已經(jīng)證實(shí)了膀胱癌的發(fā)展、預(yù)后均與細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)有關(guān)［4］。多項(xiàng)臨床研究表明，膀胱腫瘤早期即存在著異常細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)［4-5］。細(xì)胞周期蛋白D1的過度表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，可顯著降低患者術(shù)后的遠(yuǎn)期生存率［6］。細(xì)胞周期蛋白D1是一個(gè)重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，通過結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)、磷酸化以及失活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)，在G1到S過渡的細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用［7］。因此，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)和功能成為抗腫瘤研究領(lǐng)域中靶向藥物研究的重要熱點(diǎn)之一。

從多種中藥成份中提取出的寡聚二苯乙烯類化合物(oligostilbenes)具有多種生物學(xué)活性，尤其是抗腫瘤的活性正引起眾多研究者的關(guān)注［8-9］。我們研究從植物買麻藤中提取分離的中藥單體成分異丹葉大黃素(isorhapontigenin，ISO)對膀胱癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平、G0/G1細(xì)胞周期阻滯及遷移的影響。

材料和方法

1 材料

ISO由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所提供，被溶解在DMSO，濃度為10 mmol/L，并進(jìn)一步用DMSO稀釋，最后DMSO終濃度為0.1%(V/V)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。相同濃度的DMSO(0.1%，V/V)被用來作為陰性對照。

抗CDK4、CDK6、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E、P21、P53以及GAPDH抗體均購自Santa Cruz。抗P27抗體購自Abcam。新生牛血清和DMEM購自Gibco。DMSO購自Sigma，ATP生物熒光檢測試劑盒購自Promega。人源性膀胱癌UMUC3細(xì)胞由美國紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院HUANG Chuanshu教授實(shí)驗(yàn)室惠贈。由于UMUC3膀胱癌細(xì)胞株遺傳背景和較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移傾向，并且高表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1，所以選定該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 ATP生物熒光檢測法檢測細(xì)胞活性 將UMUC3細(xì)胞在含有10%新生牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3 d傳代1次。以5×103cells/well的密度接種于96孔培養(yǎng)板，以不同濃度ISO(0、5、10、20、40 和 60 μmol/L)作用于細(xì)胞共 48 h。提取ATP，熒光掃描儀測定熒光強(qiáng)度，軟件分析藥物各濃度抑制率，計(jì)算IC50，繪制抑制曲線，評估藥物作用。

2.2 UMUC3細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的檢測 采用Western blotging法檢測UMUC3細(xì)胞株細(xì)胞周期蛋白D1蛋白表達(dá)情況。進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取、定量和分離。轉(zhuǎn)膜后先后與10 g/L脫脂奶粉、鼠抗人抗體(細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E、P21、P27、P53和GAPDH)I抗4℃孵育過夜，過氧化物酶偶聯(lián)的II抗孵育，運(yùn)用ECL Western blotting kit顯色并掃描實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 UMUC3細(xì)胞周期蛋白D1 mRNA表達(dá)的檢測收集UMUC3細(xì)胞約1×106，按TRIzolTM試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:模板RNA 2 μg，10 mmol/L dNTP 1 μL，RNA 酶抑制劑(RNasin)335 nKat，Oligo dT181 μL，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，5 × 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μL，終體積為25 μL，42℃水浴30 min，采用PubMed的Primer BLAST軟件設(shè)計(jì)細(xì)胞周期蛋白D1基因PCR引物(擴(kuò)增產(chǎn)物大小408 bp)，序列如下:上游引物 5’-GAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTG-3’，下 游 引 物 5’-GAGGGCGGATTGGAAATGAACTTC-3’。同時(shí)以 GAPDH作為內(nèi)參照(擴(kuò)增產(chǎn)物大小285 bp)，上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，MGIAS-1000凝膠成像系統(tǒng)掃描定量并拍照。

2.4 PI染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測 胰酶消化并收集細(xì)胞，70%乙醇固定，4℃保存。600×g離心5 min，并用 PBS 液(含有0.5%BSA 和0.1%Triton X-100)洗2次。加入PI染色液避光保存30 min后，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)檢測細(xì)胞周期DNA含量和凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔板中，以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)UMUC3細(xì)胞直到生長到80%，以絲裂霉素處理1 h，抑制細(xì)胞的分裂。以無菌的移液器吸頭劃痕，用無血清的PBS洗滌3次后，去除劃下的細(xì)胞，加入含1%FBS血清在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，根據(jù)指定的時(shí)間進(jìn)行拍照，直到細(xì)胞長滿劃痕區(qū)域。以細(xì)胞遷移分析軟件(Cell Migration Analysis Software，Muscale LLC)定量分析細(xì)胞的遷移能力。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。對各組之間采用t檢驗(yàn)或方差分析，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ISO抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖

ISO 的化學(xué)結(jié)構(gòu)是 4'-甲氧基-3，3'，5-三羥基二苯乙烯(4-methoxyresveratrol)，見圖 1A，分子量為258 D。我們首先通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)ISO對UMUC3細(xì)胞增殖的影響。UMUC3與不同劑量ISO(0～60 μmol/L范圍)共同培養(yǎng)48 h后，倒置相差顯微鏡下觀察，如圖1B所示，20 μmol/L以上濃度顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。通過ATP生物熒光檢測法檢測細(xì)胞增殖活性，證實(shí)ISO抑制膀胱癌細(xì)胞呈明顯劑量依賴性，UMUC3細(xì)胞株的 IC50為(22.5 ±2.8)μmol/L(n=3)，見圖1C。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，5 μmol/L ISO作用48 h后可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1細(xì)胞周期阻滯，但不會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;而20 μmol/L ISO可誘導(dǎo)UMUC3細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡峰(Sub-G1峰)，見圖1D。

Figure 1.ISO inhibited proliferation of human bladder cancer UMUC3 cells.A:the structure of ISO.B:under phase-contrast microscope，representative images of UMUC3 cells pretreated with more than 20 μmol/L of ISO showed the inhibition of proliferation(×400).C:the UMUC3 cells were treated with different concentrations of ISO for 48 h，and followed by the detection of ATPase assay.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.D:flow cytometric analysis of cell cycle of UMUC3 cells treated with different concentrations of ISO for 48 h.20 μmol/L ISO could induce typical sub-G1(apoptosis)peak.圖1 ISO可顯著抑制膀胱癌UMUC3細(xì)胞的增殖

2 ISO可下調(diào)膀胱癌細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白D1蛋白和mRNA表達(dá)

UMUC3與不同劑量(0～20 μmol/L)的 ISO培養(yǎng)24 h收集UMUC3細(xì)胞的蛋白質(zhì)后，經(jīng)Western blotting檢測均可見分子量為37 kD的細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)受到顯著抑制(圖2A)。檢測其它細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，ISO并未對CDK4、CDK6、細(xì)胞周期蛋白A 、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E、P53、P21和P27等產(chǎn)生影響。圖像分析系統(tǒng)表明(圖2B)，5、10 和 20 μmol/L ISO 呈劑量依賴性抑制細(xì)胞周期蛋白D1蛋白表達(dá)(P＜0.01)。同時(shí)，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，ISO可顯著下調(diào)UMUC3細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白D1 mRNA表達(dá)，見圖2C。

Figure 2.The protein and mRNA levels of cyclin D1 could be significantly down-regulated by ISO.A:the protein expression of cyclin D1，cyclin A，cyclin B1，cyclin E，CDK4，CDK6，P53，P27 and P21 detected by Western blotting.B:the ratio of cyclin D1/GAPDH in the UMUC3 cells pretreated with ISO.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.C:the mRNA expression of cyclin D1 detected by RT-PCR.圖2 ISO可下調(diào)UMUC3膀胱癌細(xì)胞周期蛋白D1蛋白和mRNA表達(dá)

3 ISO可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1細(xì)胞周期阻滯

結(jié)合圖1D和圖2的結(jié)果，5 μmol/L ISO可顯著性下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1 mRNA水平，但不會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此后面的實(shí)驗(yàn)均采用5 μmol/L ISO進(jìn)行研究。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，5 μmol/L ISO作用于膀胱癌細(xì)胞12 h和24 h后，可出現(xiàn)不同程度G0/G1細(xì)胞周期阻滯。與對照組(47.33%)進(jìn)行比較，在沒有顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的情況下，可分別在12 h(58.82%)和24 h(63.942%)顯著誘導(dǎo)細(xì)胞 G0/G1期生長停滯 (P ＜0.01)，見圖3。

Figure 3.ISO induced G0/G1arrest of human bladder cancer UMUC3 cells.Exposure of UMUC3 cells to 5 μmol/L ISO led to significant induction of G0/G1growth arrest at both 12 h(47.33%vs 58.82%)and 24 h(47.33%vs 63.94%).AP:apoptosis.圖3 ISO可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1細(xì)胞周期阻滯

4 ISO可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移活性

經(jīng)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明，與未加ISO預(yù)處理進(jìn)行比較，5 μmol/L ISO均可在12 h和24 h顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移活性(P＜0.01)，見圖4。

Figure 4.ISO inhibited the migration of human bladder cancer UMUC3 cells detected by wound-healing assay.Cells were wounded and then treated with DMSO or ISO(5 μmol/L).At 0，12 and 24 h，phase-contrast pictures of the wounds at the same locations were taken and then migrated cells in the wound were counted.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 ISO可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞遷移活性

討 論

泌尿系統(tǒng)來源的膀胱上皮腫瘤是我國最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢，晚期患者接受進(jìn)一步化放療的治療效果仍不理想［10］。本研究證實(shí)，ISO可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，可下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白水平，誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞G0/G1周期阻滯，并可抑制膀胱癌細(xì)胞遷移。

在我國，約25%的膀胱癌患者最終可發(fā)展為肌層浸潤性膀胱癌或轉(zhuǎn)移性膀胱癌。我們實(shí)驗(yàn)室近期的研究證實(shí)，從植物買麻藤中提取分離的中藥單體成分ISO，劑量在20～60 μmol/L濃度條件下，能顯著下調(diào)包括人膀胱癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤作用［3］。在本項(xiàng)研究中，我們證實(shí)低濃度 ISO(5 μmol/L)不僅能抑制膀胱癌UMUC3細(xì)胞株的細(xì)胞增殖，并可有效地下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期阻滯。

1991年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白 D1，又稱 PRAD1、CCND1、BCL-1，其基因位于 11q13，長約 15 kb，含 5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，編碼的蛋白含295個(gè)氨基酸殘基，分子量37 kD［11］，為細(xì)胞內(nèi)主要的癌基因之一。許多研究證據(jù)表明，在各種促進(jìn)細(xì)胞炎性增殖的反應(yīng)，包括致癌物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生突變的過程中，首先可引起細(xì)胞周期的改變［12］。在腫瘤形成過程中，細(xì)胞周期蛋白D1比細(xì)胞周期蛋白D2和D3更加重要［13］。細(xì)胞周期蛋白D1對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶進(jìn)行正調(diào)控，而周期素激酶抑制劑(cyclin kinase inhibitor，CKI)對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶進(jìn)行負(fù)調(diào)控，一旦這種正負(fù)調(diào)控的平衡被破壞，細(xì)胞就可能異常增殖進(jìn)而惡變。本研究證實(shí)ISO可下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1 mRNA的表達(dá)，但沒有影響CDK4和CDK6表達(dá)，也沒有對另一類包括P21、P27和P53等CKI蛋白產(chǎn)生顯著影響。

細(xì)胞周期蛋白D1作為癌基因最早見于甲狀旁腺癌，后被證實(shí)參與包括膀胱癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤的分子病理機(jī)制。細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)并不限于某種病理類型，并且細(xì)胞周期蛋白D1在膀胱癌進(jìn)展的各個(gè)階段持續(xù)存在。曾文利等［15］證實(shí)膀胱癌組織的細(xì)胞周期蛋白D1陽性率明顯高于正常膀胱黏膜和癌旁組織。細(xì)胞周期蛋白D1在癌變危險(xiǎn)性大的良性病變、病理分級差以及浸潤性膀胱癌組織內(nèi)，均高表達(dá)并與預(yù)后密切相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白D1在膀胱癌中的異常表達(dá)可能參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程［14］。除膀胱癌外，細(xì)胞周期蛋白D1在其它多種人類腫瘤，包括乳腺癌［16］、子宮頸癌［17-18］、結(jié)腸癌［19］、前列腺癌［20］、肝癌［21］和皮膚癌［22］等均不同程度地高表達(dá)。因此，細(xì)胞周期蛋白D1是腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控及藥物治療中潛在的治療靶點(diǎn)。

例如，Li等［23］證實(shí)了在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)中，細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)缺陷后細(xì)胞遷移活性明顯減低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ISO(5 μmol/L)可顯著抑制細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，并通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)可下調(diào)膀胱癌細(xì)胞的遷移，與Li等的結(jié)果相一致。目前下調(diào)或抑制細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的分子生物學(xué)方法包括:細(xì)胞周期蛋白D1亞型(全長細(xì)胞周期蛋白D1)與小分子細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6抑制劑PD0332991［24］、小分子干擾核糖核酸(RNA干擾)［25］、細(xì)胞周期蛋白D1基因敲除［26］和抑制糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)3β 活性［27］。但這些基因治療，目前仍具有穩(wěn)定性差、需要多次重復(fù)給藥、細(xì)胞膜通透性差、轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定等不足?；颊叩陌踩允艿酵{，極大限制了臨床使用。

因此，本研究將為治療膀胱癌和其它腫瘤提供新的思路和治療策略，為進(jìn)一步研究細(xì)胞周期蛋白D1在參與實(shí)體腫瘤細(xì)胞遷移、腫瘤細(xì)胞G0/G1周期調(diào)控中的作用提供了新思路，也為臨床采用中藥單體綜合治療腫瘤提供了新的策略，尤其是對一些細(xì)胞周期蛋白D1基因高表達(dá)的腫瘤。

本研究還有不足之處，如:ISO可在mRNA和蛋白水平下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平，其具體機(jī)制尚不清楚;另外，ISO對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白如CDK均未產(chǎn)生影響，但對其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如JNK/c-Jun、JAK/Stat等是否影響，這些都有待于進(jìn)一步研究。

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