林 麗， 林紹強(qiáng)， 王曉玉△， 張 羨

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州510632;2溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生物制藥系，浙江溫州325035)

目前間充質(zhì)干細(xì)胞因其強(qiáng)大的分化潛能已經(jīng)成為科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)，間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)在組織工程領(lǐng)域顯示出了良好的應(yīng)用前景［1-2］。相比其它間充質(zhì)干細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)選用的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)具有種子細(xì)胞的很多優(yōu)良特性，如增殖活性高、免疫原性低、無(wú)致瘤性等，來(lái)源充足，無(wú)倫理問題［3］。國(guó)外有研究證實(shí)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)具有顯著的促 MSCs增殖作用［4］。但對(duì)hUCMSCs的增殖是否同樣具有促進(jìn)作用，對(duì)hUCMSCs產(chǎn)生膠原的能力有何影響，是否會(huì)加重創(chuàng)面修復(fù)過程中瘢痕組織的形成等問題，尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬采用bFGF對(duì)hUCMSCs在體外條件下進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，研究其對(duì)hUCMSCs增殖和I、III型膠原產(chǎn)生的影響，初步探討兩者聯(lián)合應(yīng)用是否有促進(jìn)組織修復(fù)、減少瘢痕形成的作用。

材料和方法

1 原代hUCMSCs的分離和培養(yǎng)

正常、足月、剖宮產(chǎn)的健康嬰兒臍帶，取自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)室，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。手術(shù)前產(chǎn)婦按常規(guī)做艾滋病病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體、丙型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體抗體等檢測(cè)。將臍帶標(biāo)本采集后于4℃保存，4 h內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。臍帶在含青霉素和鏈霉素的PBS溶液中洗盡殘余血液，剔除臍帶中的血管并剪碎至1～2 mm，酶消化法分離細(xì)胞。24 h后除去非貼壁細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，換置成相應(yīng)的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，待貼壁細(xì)胞即將鋪滿瓶底時(shí)用胰酶消化分離，按5×103/cm2密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，記為 P1;待培養(yǎng)過程中貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)板的底面時(shí)，再重復(fù)以上操作，記為 P2;以此類推傳代培養(yǎng)。

2 流式細(xì)胞術(shù)分析其表面標(biāo)記

用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表型以證實(shí)我們分離的是間充質(zhì)干細(xì)胞，而不是造血、內(nèi)皮類細(xì)胞。取第2代hUCMSCs，消化后計(jì)數(shù)2×105細(xì)胞與抗體室溫反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型。

3 hUCMSCs成脂誘導(dǎo)分化及油紅O染色

取 P3 hUCMSCs，加入含 10－6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、10 mg/L 胰島素、1×105U/L青霉素和100 mg鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于含有5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d進(jìn)行細(xì)胞換液1次，連續(xù)誘導(dǎo)2周，采用油紅O染色鑒定。

4 hUCMSCs成骨誘導(dǎo)分化及茜素紅染色

取 P3 hUCMSCs，加入含10－7mol/L地塞米松、10 μmol/L β-甘 油 磷酸 鈉和 10 mg/L 胰島 素 的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于含有5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d進(jìn)行細(xì)胞換液1次，連續(xù)誘導(dǎo)3周，采用茜素紅染色鑒定細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的能力。

5 bFGF濃度的確定

取P2 hUCMSCs，以添加不同濃度bFGF的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)含 10 μg/L、20 μg/L 和 30 μg/L 組，對(duì)照組為無(wú)bFGF培養(yǎng)，每組調(diào)整細(xì)胞濃度為3×103cells/well，分別接種于7塊96孔板內(nèi)，每組6孔，依次于培養(yǎng)第1～7 d消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)。以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，天數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。取促進(jìn)hUCMSCs增殖的最適濃度。

6 培養(yǎng)液成分及實(shí)驗(yàn)分組

培養(yǎng)液選用 DMEM/F12(Gibco)，添加1×105U/L青霉素(HyClone)和100 mg/L鏈霉素(Hy-Clone)，使用前加入10%胎牛血清(HyClone)。依據(jù)培養(yǎng)液中是否含有bFGF，實(shí)驗(yàn)分為2組:實(shí)驗(yàn)組使用含bFGF(Sigma)的培養(yǎng)液;對(duì)照組培養(yǎng)液不含bFGF。

7 MTT比色法分析2組 hUCMSCs的存活和增殖能力

使用二甲基四氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)測(cè)定A值，間接反映細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖活性。將生長(zhǎng)良好的P2 hUCMSCs以2 000 cells/well種植在7塊96孔培養(yǎng)板中，加入2種不同的培養(yǎng)液，采用bFGF對(duì)hUCMSCs進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，并設(shè)實(shí)驗(yàn)組(加bFGF)和對(duì)照組(無(wú) bFGF)，依次于培養(yǎng) 2、4、8、12、14 d后，于各小孔內(nèi)加入5 g/L噻唑藍(lán)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入二甲基亞砜200 μL，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)hUCMSCs增殖情況，并繪制生長(zhǎng)曲線。

8 RT-PCR測(cè)定其對(duì)膠原產(chǎn)生的影響

RT-PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達(dá):取P4 hUCMSCs，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各培養(yǎng)30 d后，以Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA的純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。取總RNA 0.4 μg反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，樣品－20℃保存。PCR引物由上海捷瑞生物有限公司合成，見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences for the primers

PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共40個(gè)循環(huán);最后72℃ 5 min，4℃終止反應(yīng)。以2%瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液中電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定，用基因條帶圖像處理系統(tǒng)，將電泳結(jié)束后的凝膠塊放入紫外投射儀的暗箱內(nèi)，將β-actin的密度值設(shè)定為1，目的基因條帶密度相對(duì)于β-actin的比值即為目的基因的相對(duì)密度，測(cè)量3次，取平均值。

9 Western blotting檢測(cè)I、III型膠原蛋白的表達(dá)

hUCMSCs貼壁培養(yǎng)30 d后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中含bFGF(20 μg/L)，對(duì)照組無(wú) bFGF，分別取 P4 細(xì)胞各2瓶，采用Western blotting方法測(cè)定 I、III型膠原蛋白的表達(dá)。以ImageJ圖像分析系統(tǒng)對(duì)各條帶進(jìn)行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參照。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件處理 ，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 hUCMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組貼壁細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組多，1周后可見多數(shù)呈長(zhǎng)梭形或扁平形的成纖維樣細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)組傳代時(shí)間快，傳代間隔小于對(duì)照組，當(dāng)?shù)?代hUCMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)到匯合期時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的2.5倍，見圖1。

2 流式細(xì)胞術(shù)分析其表面標(biāo)記

培養(yǎng)的2組hUCMSCs均表現(xiàn)為CD29和CD105強(qiáng)陽(yáng)性，不表達(dá) CD34、CD45和 HLA-DR。CD34、CD45和HLA-DR呈陰性，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征，見圖2。

3 成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化鑒定結(jié)果

向成脂細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后，多數(shù)細(xì)胞失去原有的長(zhǎng)梭形而變?yōu)榉蚀?、扁平的多角形?xì)胞，2周后用油紅O染色檢測(cè)脂肪滴為陽(yáng)性;在細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)3周后茜素紅染色陽(yáng)性，細(xì)胞內(nèi)可因鈣質(zhì)沉積而顯現(xiàn)紅色，見圖3。

Figure 1.The cell morphology and growth after treatment with bFGF(20 μg/L).圖1 2組細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀況

4 加入不同濃度bFGF培養(yǎng)的hUCMSCs的生長(zhǎng)曲線

加入bFGF后，前3 d不同濃度的bFGF對(duì)hUCMSCs增殖的影響不明顯，4 d后細(xì)胞增殖明顯，6 d到達(dá)高峰，30 μg/L、20 μg/L 和 10 μg/L bFGF 組的細(xì)胞數(shù)分別為13.6 ×103、13.43 ×103和9.33 ×103，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析顯示，20 μg/L、30 μg/L 與10 μg/L比較有顯著差異(P ＜0.05)，20 μg/L 與 30 μg/L組比較無(wú)顯著差異(P ＞0.05)，10 μg/L、20 μg/L 組與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)，見圖4。上述結(jié)果提示選取20 μg/L是促進(jìn)hUCMSCs增殖的最佳濃度，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。

5 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組hUCMSCs的MTT結(jié)果及生長(zhǎng)曲線

依據(jù)MTT測(cè)定結(jié)果，繪制實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，見圖5。2組之間吸光度值比較差異有顯著性(P＜0.05)。接種后第1 d 2組細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)平緩，表現(xiàn)同生長(zhǎng)曲線潛伏期。第4 d起2組保持較高的增殖活性，呈快速生長(zhǎng)，構(gòu)成生長(zhǎng)曲線的指數(shù)增長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖明顯。2組細(xì)胞相比:實(shí)驗(yàn)組A值明顯增加(P ＜0.05)。

Figure 2.Flow cytometry analysis of the surface markers on hUCMSCs.圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析hUCMSCs的表面標(biāo)記

Figure 3.Oil red O and alizarin red staining of hUCMSCs.圖3 hUCMSCs的油紅O染色及茜素紅染色

Figure 4.Growth curves of hUCMSCs stimulated with different concentrations of bFGF圖4 不同濃度bFGF作用hUCMSCs的生長(zhǎng)曲線

Figure 5.Growth curves of control group and bFGF(20 μg/L)treatment group.Mean ± SD.n=3.*P ＜ 0.05 vs control.圖5 bFGF干預(yù)后2組hUCMSCs的生長(zhǎng)曲線

6 RT-PCR測(cè)定2組hUCMSCsⅠ、III型膠原mRNA表達(dá)的變化

經(jīng)bFGF處理的細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)情況見圖6。2組間Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。

7 Western blotting的檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，I、III型膠原蛋白表達(dá)減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖7。

討 論

Figure 6.Effects of bFGF on collagen I and III mRNA expression in hUCMSCs.hUCMSCs were treated with 20 μg/L bFGF for 30 d.M:DNA marker;1，2，3:bFGF group;4，5，6:control group;1，4:collagen I;2，5:collagen Ⅲ;3，6:β-actin.Mean ± SD.n=3.*P ＜ 0.05 vs control.圖6 RT-PCR檢測(cè) bFGF對(duì) hUCMSCs I、III型膠原 mRNA表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的P2 hUCMSCs的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:2組 hUCMSCs均表現(xiàn)為 CD29和CD105強(qiáng)陽(yáng)性，CD34、CD45和HLA-DR陰性。不表達(dá)造血干細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面抗原標(biāo)志CD34、白細(xì)胞抗原CD45，證明其為非造血、非內(nèi)皮類細(xì)胞［5］;HLA-DR陰性說(shuō)明該細(xì)胞免疫原性很低。因此，本次實(shí)驗(yàn)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征。成脂及成骨分化成功提示我們分離培養(yǎng)的是間充質(zhì)干細(xì)胞，可以滿足向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)的需要。有大量國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)MSCs能分化為心肌細(xì)胞，分化的細(xì)胞具有相似的動(dòng)作電位和形成閏盤結(jié)構(gòu)［6］，可應(yīng)用于改善肌原性心衰。我們已成功地將hUCMSCs注射于壓力性尿失禁的大鼠尿道周圍，并觀察到其存活、增殖，改善了尿失禁的體征，形態(tài)學(xué)上觀察可以修復(fù)尿道周圍的支持結(jié)構(gòu)，但在盆底器官中的應(yīng)用未見報(bào)道。有學(xué)者將hUCMSCs注射進(jìn)脛前肌，脛前肌預(yù)先用布比卡因損傷，在體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)下，hUCMSCs體內(nèi)存活2周后分化為骨骼肌細(xì)胞，見受損的肌肉完全修復(fù)［7］。

Figure 7.Effects of bFGF on collagen I and III protein expression in hUCMSCs.hUCMSCs were treated with 20 μg/L bFGF for 30 d.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖7 Western blotting檢測(cè)bFGF對(duì) hUCMSCs I、III型膠原蛋白表達(dá)的影響

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，bFGF對(duì)干細(xì)胞的增殖具有重要的促進(jìn)作用。bFGF是一種作用較廣泛的細(xì)胞因子，它是一種強(qiáng)絲裂原，對(duì)來(lái)源于中胚層和外胚層的組織具修復(fù)和再生作用，可促進(jìn)造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞增殖。Akino等［8］發(fā)現(xiàn)在bFGF單獨(dú)作用或合用2 d后，體外培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比有顯著增長(zhǎng)(P＜0.05)，顯示了bFGF促M(fèi)SCs的增殖的作用。雷軍等［9］研究了bFGF、IL-1α、IL-3、IL-6 等因子對(duì)人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖的作用，發(fā)現(xiàn)bFGF促增殖作用最顯著。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了bFGF濃度為20 μg/L對(duì)體外培養(yǎng)的HUCMSCs具有很明顯的促進(jìn)增殖的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。增加bFGF濃度并不能進(jìn)一步發(fā)揮促增殖作用，其機(jī)制可能是bFGF與hUCMSCs表面的受體結(jié)合，通過胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮促增殖作用，因受體數(shù)量有限，當(dāng)bFGF達(dá)到一定濃度時(shí)受體飽和，此時(shí)繼續(xù)增加濃度但促增殖作用不再增強(qiáng)。

有研究已證實(shí)了bFGF具有促損傷修復(fù)的作用［10］。Nakagawa等［11］合用 hMSCs和 bFGF 作用于裸鼠的皮膚損傷，傷口面積明顯縮小(P＜0.01)，表明hMSCs與bFGF合用可加快皮膚創(chuàng)面愈合。Anna等［12］用大鼠建立動(dòng)物模型，用 bFGF作用培養(yǎng)后的自體同源肌細(xì)胞注入大鼠損傷的尿道壁，2周后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠尿道移植區(qū)細(xì)胞的數(shù)量比對(duì)照組增加46%。但bFGF在促創(chuàng)傷修復(fù)作用同時(shí)是否會(huì)引起瘢痕增生已受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的過度沉積且降解減少是增生性瘢痕形成的主要原因［13］。有研究證實(shí)在瘢痕組織內(nèi)膠原蛋白的合成是正常細(xì)胞的3倍。Sato等［14］研究表明，瘢痕疙瘩組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量顯著增加，何威等［15］研究發(fā)現(xiàn)疤痕疙瘩成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA升高，其膠原合成量也明顯高于正常皮膚真皮成纖維細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)提示bFGF在促進(jìn)hUCMSCs增殖的情況下減少了hUCMSCs膠原的合成，對(duì)hUCMSCsⅠ型、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)起減少的作用，Western blotting檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，提示其在促進(jìn)創(chuàng)面愈合的同時(shí)并不會(huì)引起Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白沉積而導(dǎo)致瘢痕增生。其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們可考慮將hUCMSCs與bFGF聯(lián)合應(yīng)用于盆底功能障礙性疾病，有效地解決植入聚丙烯網(wǎng)片后所致網(wǎng)片侵蝕、暴露、陰道壁組織瘢痕增生攣縮的問題。本次研究主要探討在體外環(huán)境中bFGF的干預(yù)下hUCMSCs增殖及I、III膠原產(chǎn)生的影響，但hUCMSCs與bFGF合用移植于體內(nèi)受損肌肉組織的微環(huán)境中是否直接分化成肌纖維母細(xì)胞，并修復(fù)盆底受損組織需要我們進(jìn)一步研究。

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