王 琳， 聶 晶， 滕天明， 李宏仕， 于雪芳， 馬 駿△

(1天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070;2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052)

Apelin是1998年由 Tatemoto等［1］通過(guò)反向藥理學(xué)方法從牛胃的分泌物中發(fā)現(xiàn)的含77個(gè)氨基酸序列的多肽類(lèi)物質(zhì)，是孤兒G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體。APJ的結(jié)構(gòu)與血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)1型受體(angiotensinⅡ type 1 receptor，AT1receptor)非常相似(54%的跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)相同)，但并不與AngⅡ結(jié)合［2］。Apelin/APJ系統(tǒng)廣泛分布于心臟、肺臟、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脂肪組織等。近年發(fā)現(xiàn)apelin/APJ系統(tǒng)參與高血壓、心衰、肥胖、糖耐量減低和2型糖尿病、HIV感染、胃潰瘍等疾病的發(fā)病過(guò)程。在心血管系統(tǒng)，apelin通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌等形式發(fā)揮正性肌力作用、擴(kuò)張血管、抑制心臟重構(gòu)、調(diào)節(jié)血壓及體液平衡等作用。Apelin基因位于人X染色體的q25～26.1，編碼的前體蛋白由77個(gè)氨基酸組成，在不同的組織中被加工生成分別含12、13、17、36 個(gè)氨基酸的多肽，其中 apelin-36 和apelin-13較為常見(jiàn)［1］。目前研究表明apelin的正性肌力作用是通過(guò)激活磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和內(nèi)質(zhì)膜鈉氫交換體(Na+/H+exchanger，NHE)、鈉鈣交換體(Na+/Ca2+exchanger，NCX)實(shí)現(xiàn)的，心室肌細(xì)胞瞬時(shí)鈉電流(INa)的幅度和激活情況調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Na+濃度，進(jìn)而通過(guò)NCX增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子發(fā)揮正性肌力作用［3］。因此，apelin對(duì)INa的調(diào)節(jié)對(duì)其正性肌力作用至關(guān)重要。據(jù)Chamberland等［4］報(bào)道，100 nmol/L的apelin-13和apelin-17均能明顯增加狗正常左室心肌細(xì)胞INa峰電流幅度，提示apelin通過(guò)增加INa影響心室肌細(xì)胞的興奮性和傳導(dǎo)特性。已有研究的方向主要是集中于apelin對(duì)于缺血-再灌注心肌細(xì)胞的保護(hù)作用、apelin的正性肌力作用及其在心力衰竭、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展中的可能作用，而apelin對(duì)缺血誘發(fā)的室性心律失常有無(wú)作用、對(duì)缺血心肌細(xì)胞有無(wú)正性肌力作用及其對(duì)缺血心室肌細(xì)胞電生理特性和相應(yīng)離子通道蛋白表達(dá)的影響尚不明了，且相關(guān)研究報(bào)道也較少。本研究旨在探討apelin-13對(duì)缺血大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響，以期揭示其對(duì)缺血心室肌細(xì)胞電生理特性的作用。

材料和方法

1 材料

健康雄性Wistar大鼠，體重200～250 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Apelin-13由ANASpec提供，Na+通道蛋白V型α亞單位(sodium channel protein，type V，alpha subunit，SCN5A)抗體購(gòu)自Santa Cruz，余為市售分析提純?cè)噭?/p>

2 試劑配制

2.1 臺(tái)氏液 NaCl 136 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgCl21.0 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，glucose 10 mmol/L，用 2 mol/L NaOH滴定pH至7.40。

2.2 無(wú)鈣臺(tái)氏液 即臺(tái)氏液中去除CaCl2。

2.3 KB 液 Glutamic acid 70 mmol/L，taurine 15 mmol/L，KCl 30 mmol/L，KH2PO410 mmol/L，MgCl20.5 mmol/L，EGTA 0.5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，glucose 10 mmol/L，用 5 mol/L KOH滴定 pH至7.35。

2.4 酶解液 膠原酶Ⅱ(0.16 g/L)和小牛血清白蛋白0.16 g/L加入50 mL無(wú)鈣臺(tái)氏液中。

2.5 INa記錄的電極內(nèi)液 CsCl 20 mmol/L，CsF 110 mmol/L，NaCl 5 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Mg-ATP 5 mmol/L，用 3 mol/L CsOH 滴定pH至7.20。

2.6 INa記錄的電極外液 氯化膽堿100 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，MgCl22 mmol/L，4-AP 5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，glucose 10 mmol/L，CsCl 20 mmol/L，CdCl20.3 mmol/L，用 5 mol/L NaOH 滴定pH至7.35。

2.7 K-H 液 NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，glucose 11 mmol/L，CaCl21.4 mg(1 000 mL)。

2.8 缺血K-H液 將K-H液中g(shù)lucose替換為乳酸鈉，不通氧，NaOH調(diào)pH至7.00。

3 大鼠缺血心室肌細(xì)胞模型的建立及動(dòng)物處理

40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N組，n=10)、正常加 apelin-13組(N+A 組，n=10)、缺血組(I組，n=10)、缺血加apelin-13組(I+A組，n=10)，4組動(dòng)物均采用Langendorff灌流系統(tǒng)酶解法分離心室肌細(xì)胞，N組和N+A組動(dòng)物心室肌細(xì)胞采用正常細(xì)胞外液，N+A組細(xì)胞外液中加入apelin-13;I組和I+A組采用缺血細(xì)胞外液，I+A組細(xì)胞外液中加入apelin-13，缺血20 min，建立心肌細(xì)胞水平的缺血模型，采用Multiclamp 700B膜片鉗系統(tǒng)，采用全細(xì)胞記錄模式，記錄各組INa，數(shù)據(jù)收集和分析采用Pclamp 10.1(Axon Instrument)，電容補(bǔ)償75%。電流-電壓(I-V)曲線的制作:以各個(gè)測(cè)試電壓為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的電流密度為縱坐標(biāo)，作出電流-電壓關(guān)系曲線，即I-V曲線。激活動(dòng)力學(xué)曲線的制作:以電流的相對(duì)值(I/Imax)對(duì)條件脈沖電壓作圖，得出激活動(dòng)力學(xué)曲線。按 Boltzmann方程 I/Imax=1/{1+exp［(Vm-V1/2)/k］}進(jìn)行曲線擬合。

另取雄性Wistar大鼠16只分為對(duì)照組(N組，n=4)、對(duì)照加 apelin組(N+A組，n=4)、缺血組(I組，n=4)、缺血加 apelin組(I+A 組，n=4)，建立Langendorff心臟離體灌流模型，N組和N+A組分別灌流正常K-H液和加apelin-13的K-H液，I組和I+A組分別灌流缺血K-H液和apelin-13加缺血K-H液，缺血20 min，經(jīng)左房插入水囊連接壓力監(jiān)護(hù)，持續(xù)記錄心電圖和心腔內(nèi)壓力，采集左室發(fā)展壓(left ventricle developed pressure，LVDP)、左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室壓力變化最大值(maximum change in left ventricular pressure over time，dp/dtmax)和最小值(minimum change in left ventricular pressure over time，dp/dtmin)，按Demiryürek等［5］文獻(xiàn)計(jì)算各組室性心律失常發(fā)生率及評(píng)分，灌注結(jié)束后留取左心室心肌標(biāo)本，保持于液氮中，RT-PCR和Western blotting檢測(cè)SCN5A表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Apelin-13對(duì)INa的影響

Apelin-13(100 nmol/L)在N+A組和I+A組均能增加INa幅度，見(jiàn)圖1。I-V曲線分析顯示N+A組比N組INa幅度增大32%［(-86±13)pA/pF］，I+A組比I組INa幅度增大18%［(-52±15)pA/pF］，見(jiàn)圖2、3;然而I-V曲線分析apelin-13并未改變最大傳導(dǎo)速度，N、N+A、I、I+A 組分別為(3.2 ±0.2)pS/pF、(3.1 ±0.3)pS/pF、(2.9 ±0.1)pS/pF、(2.8 ±0.4)pS/pF，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示apelin-13可能是通過(guò)改變Na+通道門(mén)控特性而非激活更多的Na+通道而增加INa峰值。各組的半激活電壓(V1/2)分別為(-21.9±0.6)mV、(-28.7±0.3)mV、(-30.5±0.7)mV 和(-36.8±0.2)mV;Boltzmann曲線各組斜率分別為5.6±0.3、5.1±0.4、4.3±0.3和4.9±0.6，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);V1/2值N+A組比N組改變(-5.9±0.8)mV，I+A 組V1/2比 I組改變(-7.7±1.3)mV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示apelin-13使正常和缺血組心室肌細(xì)胞Na+通道更容易開(kāi)放。

Figure 1.Effect of apelin-13 on INain normal and ischemic ventricular myocytes.A:N group;B:N+A group;C:I group;D:I+A group.Apelin-13 increased INadensity in both N+A group and I+A group.圖1 Apelin-13對(duì)正常和缺血心室肌細(xì)胞INa的影響

Figure 2.I-V curves of N group and N+A group.圖2 正常心室肌細(xì)胞的I-V曲線

Figure 3.I-V curves of I group and I+A group.圖3 缺血心室肌細(xì)胞的I-V曲線

2 Apelin-13對(duì)室性心律失常的影響

各組室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)開(kāi)始時(shí)間、室性心動(dòng)過(guò)速(ventricular tachycardia，VT)持續(xù)時(shí)間、心室顫動(dòng)(ventricular fibrillation，VF)持續(xù)時(shí)間及心律失常評(píng)分(arrhythmia score，AS)情況見(jiàn)表1。N+A組與N組比較、I+A組與I組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組灌流過(guò)程中室性心律失常情況Table 1.Ventricular arrhythmias during perfusion in the four groups(mean±SD.n=10)

3 Apelin-13對(duì)左室功能的影響

各組 LVEDP、LVDP、dp/dtmax和 dp/dtmin指標(biāo)比較，N+A組LVEDP低于N組，LVDP、dp/dtmax和 dp/dtmin高于N組;I+A組LVEDP低于I組、LVDP高于I組，dp/dtmax、dp/dtmin高于 I組，見(jiàn)表 2。

4 Apelin-13對(duì)SCN5A表達(dá)的影響

SCN5A抗體特異性識(shí)別和結(jié)合大鼠心室肌細(xì)胞Na+通道蛋白，通過(guò)Western blotting檢驗(yàn)呈現(xiàn)出分子質(zhì)量約260 kD的蛋白條帶。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照，4組β-actin表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=4，P＞0.05)，4組SCN5A的表達(dá)灰度值分別為28.8±3.6、29.4±4.1、30.1±2.9和31.3±3.8，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=4，P＞0.05)，見(jiàn)圖4。這提示apelin-13不影響Na+通道蛋白的表達(dá)。

表2 各組灌流過(guò)程中心臟功能指標(biāo)Table 2.The cardiac function parameters during perfusion(mean±SD.n=4)

討 論

鈉通道活性與動(dòng)作電位的形成(0期)有關(guān)，是心肌細(xì)胞去極化主要的跨膜離子流，影響心肌細(xì)胞的興奮和傳導(dǎo)［6］。Apelin是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的心臟正性肌力物質(zhì)之一［7］。離體大鼠心臟灌注apelin(0.01～10 nmol/L)使心肌收縮力增強(qiáng)，誘導(dǎo)劑量依賴性的正性變力作用，顯著增高dp/dtmax;其正性肌力是通過(guò)結(jié)合并活化其自身特異性受體而發(fā)揮作用的，并不依賴于內(nèi)源性血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素、兒茶酚胺和NO的釋放［8］。Apelin對(duì)健康大鼠和心肌梗死導(dǎo)致心力衰竭大鼠的心臟均有正性肌力作用，給大鼠持續(xù)靜脈輸入Apelin約20 min，會(huì)發(fā)現(xiàn)左室最大壓力、dp/dtmax和每搏輸出量均顯著增加，但不增加心率和左室舒張末期容積［9］，在結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈致心肌梗死后6周心力衰竭大鼠，持續(xù)靜脈注射apelin也得到了同樣的結(jié)果。Apelin-13是具有活性的最短氨基酸序列，能更有效地占領(lǐng)APJ，其發(fā)揮的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)也更強(qiáng)大，因此本研究中選擇apelin-13觀察其對(duì)大鼠缺血心肌細(xì)胞INa的影響。本研究中apelin-13對(duì)正常和缺血心室肌均有正性肌力作用，N+A和I+A組的左室收縮功能較N組和I組均有改善。

Figure 4.The effect of apelin-13 on the expression level of SCN5A detected by Western blotting.圖4 Western blotting檢驗(yàn)Apelin-13對(duì)各組SCN5A表達(dá)的影響

文獻(xiàn)報(bào)道 apelin 對(duì)鉀、鈣電流(Ito、IK，sus、ICa)沒(méi)有影響，其通過(guò)PLC和PKC途徑增加心肌收縮力，它的正性肌力作用與NHE和NCX激活有關(guān)［10］。但是否apelin直接增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度或者提高肌原纖維對(duì)鈣離子敏感性尚存爭(zhēng)議。本研究發(fā)現(xiàn)apelin-13增加大鼠缺血心室肌細(xì)胞的INa幅度達(dá)18%，改變INa的半激活電壓達(dá)(-7.7±1.3)mV，I-V曲線的最大傳導(dǎo)速度并未改變。Boltzmann曲線各組斜率4組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;V1/2值N+A組和I+A組分別比N組和I組變得更負(fù)，提示apelin-13改變INa離子通道的門(mén)控特性，使正常和缺血組心室肌細(xì)胞Na+通道更容易開(kāi)放。

因此，INa的增加可能與激活電壓的驅(qū)動(dòng)力增加以及膜通道動(dòng)力學(xué)的改變有關(guān)，可能與Na+通道蛋白表達(dá)和被激活數(shù)量無(wú)關(guān)。

Apelin能提高心肌細(xì)胞自發(fā)性激動(dòng)的放電頻率和傳導(dǎo)速度［3］，本研究發(fā)現(xiàn)apelin介導(dǎo)的心肌細(xì)胞興奮性增加與INa的激活有關(guān)，apelin-13使正常和缺血組心室肌細(xì)胞Na+通道更容易開(kāi)放，但各組間室性心律失常發(fā)生情況無(wú)差別，提示apelin-13可能不具備抗心律失常作用。Ellinor等［11］研究發(fā)現(xiàn)，73例孤立性房顫患者的血漿apelin水平顯著下降，這提示apelin水平降低可能參與了此類(lèi)心律失常的發(fā)病機(jī)制。但其水平改變究竟是疾病發(fā)生和發(fā)展的結(jié)果，還是發(fā)病促發(fā)因素，目前尚不明確。

本研究局限性在于樣本例數(shù)偏少，未研究在體大鼠缺血心臟模型應(yīng)用apelin-13后心律失常、左室收縮功能情況及INa等細(xì)胞電生理特性方面的變化。

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