姜?jiǎng)佻?，曹建彪，范公?/p>

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)是臨床常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均較高［1-2］，對(duì)其早發(fā)現(xiàn)、早診斷以及早治療具有重要意義。研究證實(shí)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3，GPC-3)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展以及診療密切相關(guān)［3-5］，其診斷敏感性和特異度較甲胎蛋白(alpha-Fetoproteins，AFP)均有增高，被認(rèn)為是一種新型重要的HCC腫瘤標(biāo)記物［6-7］，二者聯(lián)合檢測(cè)可提高HCC早期診斷率［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，GPC-3與HCC的分化程度及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)［9］，也有研究表明GPC-3表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)和臨床分期有關(guān)［10］，本文旨在探討GPC-3對(duì)HCC的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年1月—2012年7月北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍肝病治療中心住院的HCC 59例為HCC組，均符合2011年版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理學(xué)、影像學(xué)確診，入院前未接受放療、化療、免疫治療或中藥治療等。男51例，女8例;年齡36～79歲。選擇同期該院確診的肝硬化住院患者35例為肝硬化組，均符合2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)修訂的《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)，男26例，女9例;年齡30～76歲;肝功能分級(jí)均與HCC組在同一水平。選擇同期該院健康體檢中心體檢者30例為健康對(duì)照組，男17例，女13例;年齡27～66歲;經(jīng)檢查各型肝炎病毒標(biāo)志物及AFP均為陰性，無心、肝、肺、腎功能異常。3組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 材料與方法 受檢者在入院后均清晨空腹采集靜脈血3 ml，不抗凝，1000 r/min離心5 min，留取血清轉(zhuǎn)移至另一清潔的EP管內(nèi)放置于－70℃冰箱內(nèi)保存，統(tǒng)一檢測(cè)。血清GPC-3測(cè)定采用酶聯(lián)免疫定量法檢測(cè)，ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司(編號(hào)為DY2119)，計(jì)算平均光密度值(optical density，OD值)，通過使用計(jì)算機(jī)軟件產(chǎn)生四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合，從而創(chuàng)建GPC-3濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD值計(jì)算每個(gè)樣品中GPC-3的含量;AFP檢測(cè)采用電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定，使用同型配套試劑，檢測(cè)值＞200 ng/ml者為陽(yáng)性，各項(xiàng)操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，成組資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用Pearson χ2檢驗(yàn)，影響因素采用Logistic回歸模型分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 GPC-3濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 以GPC-3標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)2倍逐級(jí)稀釋濃度為橫坐標(biāo)，以光密度結(jié)果檢測(cè)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線回歸方程為:Y=0.0003X －0.0014，相關(guān)系數(shù) r≈1，見圖1。

圖1 酶聯(lián)免疫定量法檢測(cè)血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 血清中GPC-3和AFP濃度檢測(cè) HCC組血清GPC-3表達(dá)水平和AFP含量均明顯高于肝硬化組及健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，肝硬化組血清GPC-3表達(dá)水平和AFP含量與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 3組血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、甲胎蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果(±s)

表1 3組血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、甲胎蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果(±s)

注:與肝硬化組及健康對(duì)照組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(pg/ml)甲胎蛋白(ng/ml)原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組 59 938.00 ±404.67a285.64 ±452.39a肝硬化組 35 338.00 ±238.00 4.54 ±5.39健康對(duì)照組30 304.67 ±204.67 1.97 ±1.52

2.3 血清GPC-3濃度檢測(cè)的ROC曲線 根據(jù)上述3組人群GPC-3檢測(cè)結(jié)果繪制特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，見圖 2。曲線下面積為0.912，95%可信區(qū)間為0.859～0.965，當(dāng)取GPC-3為601.33 pg/ml是判斷HCC的界值時(shí)，GPC-3診斷 HCC的敏感性為89.3%，特異度為90.8%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為 89.3%，陰性預(yù)測(cè)值為86.8%。以200 ng/ml為 AFP陽(yáng)性界值，HCC組AFP陽(yáng)性率為32.2%(19/59)，以601.33 pg/ml為GPC-3陽(yáng)性界值，HCC組GPC-3陽(yáng)性率為84.7%(50/59)。AFP與GPC-3聯(lián)合檢測(cè)可使HCC的確診率提高至88.1%(52/59)。

圖2 血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3濃度檢測(cè)的ROC曲線

2.4 HCC組GPC-3表達(dá)與AFP水平及臨床參數(shù)的Logistic回歸模型分析 對(duì)HCC組血清中GPC-3表達(dá)水平為因變量(Y=1，GPC-3＞601.33 pg/ml;Y=2，GPC-3≤601.33 pg/ml)，以年齡、性別、有無門脈癌栓、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、Child-pugh分級(jí)、有無HBsAg感染、AFP水平、腫瘤最大直徑為自變量，進(jìn)行Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示GPC-3表達(dá)與年齡、性別、有無門脈癌栓、TNM分期、Child-pugh分級(jí)、有無HBsAg感染、AFP水平及腫瘤最大直徑均無相關(guān)性(P＞0.05)，而僅與有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有高度相關(guān)性(P＜0.05)，見表2。

表2 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3表達(dá)與甲胎蛋白水平和臨床參數(shù)Logistic回歸模型分析

3 討論

GPC-3屬于膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)超家族成員，主要通過糖基(GPI)錨定于細(xì)胞膜上［11］，GPC-3基因位于人類的X染色體(Xq26)上，全長(zhǎng)大約900 kb，其編碼的含580個(gè)氨基酸的核心蛋白質(zhì)前體可裂解生成1個(gè)40 kDa氨基(N)端蛋白和1個(gè)30 kDa膜結(jié)合羧基(C)終端蛋白，2個(gè)硫酸乙酰肝素(HS)糖鏈連接到C-末端，參與信號(hào)間的傳遞［12］，通過多種信號(hào)通路直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化、黏附及轉(zhuǎn)移等過程［13-15］，尤其在HCC組織中發(fā)揮了重要作用［16-17］，GPC-3在核心蛋白下游富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)區(qū)的下端，即第358位精氨酸和359位絲氨酸處可以被酶切割而分成2段，使N-端約含40 kDa的GPC-3蛋白成為可溶性蛋白片段而分泌入血，這是外周循環(huán)血清能夠檢測(cè)GPC-3的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

本研究采用酶聯(lián)免疫定量法檢測(cè)GPC-3標(biāo)準(zhǔn)品濃度，結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線近似直線，相關(guān)系數(shù)接近1，說明曲線擬合度較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的重復(fù)性。同時(shí)檢測(cè)了59例HCC、35例肝硬化及30例健康體檢者中 GPC-3表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)HCC組血清GPC-3呈現(xiàn)高表達(dá)，而在肝硬化組及健康對(duì)照組呈現(xiàn)低表達(dá)甚至無表達(dá)。本研究采用ROC曲線法，標(biāo)定GPC-3為601.33 pg/ml是診斷HCC的陽(yáng)性界值，敏感性為 89.3%，特異度為90.8%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為 89.3%，陰性預(yù)測(cè)值為86.8%;HCC組AFP陽(yáng)性率為32.2%，GPC-3陽(yáng)性率為84.7%，AFP與GPC-3聯(lián)合檢測(cè)可使HCC確診率提高至88.1%。研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清GPC-3濃度明顯高于肝炎后肝硬化、慢性肝炎等肝臟良性病變患者及健康對(duì)照組［18-20］。江楓等［21］應(yīng)用ELISA檢測(cè)計(jì)算發(fā)現(xiàn)當(dāng)以3.19 μg/ml為診斷界值時(shí)，GPC-3診斷HCC的敏感性和特異度分別為85.4%及98.9%，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，GPC-3能顯著提高小肝癌與肝硬化結(jié)節(jié)的鑒別診斷。吳詩(shī)品等［22］研究顯示HCC組血清GPC-3濃度明顯高于肝內(nèi)良性占位組和正常對(duì)照組，根據(jù) ROC曲線，取412.6 pg/ml為診斷界值時(shí)，GPC-3診斷HCC的敏感性和特異度分別為63.2%和89.3%。付順軍等［23］研究結(jié)果顯示，HCC患者血清中 GPC-3濃度明顯高于肝硬化患者和健康者，而肝硬化患者和健康者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，診斷HCC的敏感性和特異度分別為88.1%和85.9%。Zhang等［24］利用磁粒子為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光技術(shù)(CLEIA)測(cè)定正常肝臟、肝硬化、繼發(fā)性肝癌及原發(fā)性肝癌患者血清中GPC-3的濃度，發(fā)現(xiàn)GPC-3在原發(fā)性肝癌患者的血清中高表達(dá)，而在正常成人、肝炎、肝硬化中無表達(dá)或低表達(dá)，可有效的診斷原發(fā)性肝癌，是HCC的一個(gè)重要且有效的腫瘤標(biāo)記物。因此我們認(rèn)為GPC-3有可能成為替代AFP，或更有價(jià)值的肝癌標(biāo)志物分子。

本研究進(jìn)一步結(jié)合臨床參數(shù)進(jìn)行Logistic回歸模型分析后發(fā)現(xiàn)，GPC-3表達(dá)僅與有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈高度相關(guān)，而有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和HCC的預(yù)后密切相關(guān)，因此我們推測(cè)GPC-3的高表達(dá)在某種程度上與HCC預(yù)后相關(guān)。Yao等［25］研究發(fā)現(xiàn)HCC患者血清中AFP及GPC-3蛋白分布量不具有相關(guān)性，本研究結(jié)果與該文獻(xiàn)報(bào)道一致。王攀等［26］研究顯示，血清中GPC-3和AFP的表達(dá)均與HCC的臨床分期、病理分級(jí)、肝硬化程度有關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者GPC-3 mRNA的表達(dá)與血清AFP水平、門脈癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、HBsAg及年齡等不相關(guān)，而與腫瘤直徑有關(guān)［27］。不同學(xué)者得出不同結(jié)論，GPC-3的表達(dá)與HCC預(yù)后的關(guān)系尚無明確結(jié)論，期待更多相關(guān)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，GPC-3在HCC診斷中有較高的敏感性和特異度，尤其是在AFP陰性的HCC中，可成為診斷HCC重要的腫瘤標(biāo)志物之一，其表達(dá)與HCC有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，由于本文觀察例數(shù)較少，有關(guān)機(jī)制和實(shí)驗(yàn)結(jié)論尚需進(jìn)一步深入研究。

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