陳陽述 李茹冰 李 健 吳新榮 孫智平 陳 新 萬華印

(解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心，廣東 廣州 510602)

鹽酸椒苯酮胺(PPTA)為我國原始創(chuàng)新的心血管化學(xué)藥，是鈣增敏劑類強(qiáng)心藥及心肌保護(hù)劑〔1〕。臨床前研究發(fā)現(xiàn)，其具有良好的保護(hù)受損心肌、增強(qiáng)心功能并降低心肌耗氧量的雙重作用;可增加心肌收縮蛋白對Ca2+的敏感性，而不增加心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，甚至有抗Ca2+超載作用，無致心律失常的危險〔2，3〕;可通過開放血管平滑肌細(xì)胞鈣敏感鉀離子通道產(chǎn)生舒張血管作用;藥物代謝快，不會在體內(nèi)積蓄〔4〕。目前國內(nèi)外尚無同類藥物，已獲得SFDA頒發(fā)的1.1類化學(xué)藥品臨床試驗批件。為評價其安全性，需了解它有否致突變作用，課題組依據(jù)中國藥典2005年版二部及新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編(藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué))的有關(guān)技術(shù)要求，進(jìn)行了鹽酸椒苯酮胺Ames試驗、小鼠微核試驗及中國倉鼠肺細(xì)胞染色體畸變試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥與動物 鹽酸椒苯酮胺:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物化學(xué)室合成，批號88102，純度 (99±0.5%)。陽性對照品 2，7，-2-氨基芴(2，7-2AF)，2-氨基芴(2-AF)，9-芴酮，甲基甲烷磺酸酯(MMS)，正定霉素(DMC)，Vp16，環(huán)磷酰胺(CP)，上海第十二制藥廠生產(chǎn);卡鉑(Carboplatin)，山東齊魯藥廠生產(chǎn);均為化學(xué)純。試驗菌株:組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏桿菌TA97、TA98、TA100和TA102系中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所保存菌種，經(jīng)檢定符合要求后凍存于-80℃冰箱。代謝活化劑自行制備。

1.1.2 實驗動物 雄性昆明種小鼠，體重22～25 g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物所。中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL)，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 回復(fù)突變試驗(Ames試驗) 參照鼠傷寒沙門氏桿菌/哺乳動物微粒體酶致突變試驗方法，對鹽酸椒苯酮胺進(jìn)行非代謝活化和代謝活化的平板參入檢測。從液氮罐中取出菌種，37℃ 水浴融化后接種到營養(yǎng)肉湯中，37℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。試驗藥物鹽酸椒苯酮胺共設(shè)7個劑量組，分別為 0.1、1、5、10、20、100、1 000 μg/皿。另設(shè)空白對照組和陽性對照組。非活化系統(tǒng)(加0.5 ml PBS)和活化系統(tǒng)(加0.5 ml S9混合液)并加入0.1 ml不同濃度的菌液及0.1 ml不同濃度的鹽酸椒苯酮胺，混勻后倒入平板鋪平。每個劑量2皿。各種菌的陽性對照組加相應(yīng)的陽性誘變劑。將所有培養(yǎng)皿倒置于(37±1)℃培養(yǎng)箱中孵育48 h，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。以回變菌落數(shù)超過對照組2倍以上視為Ames陽性。

1.2.2 鹽酸椒苯酮胺的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 預(yù)試驗:以鹽酸椒苯酮胺58.5 mg/kg，按0.2 ml/10 g體重靜脈注射。分別在給藥后18、24、30、48及72 h后處死3只小鼠，取股骨骨髓制片，Giemsa染色，計數(shù)1 000個嗜多染紅細(xì)胞數(shù)和含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，以千分率表示。結(jié)果顯示，對照組與各采樣點的微核率無顯著差異，故正式實驗時采用給藥后24 h取骨髓制片。

正式試驗:將30只小鼠按體重隨機(jī)分成5組，每組6只。設(shè)鹽酸椒苯酮胺3個劑量組，分別為58.5、29.0、14.5 mg/kg;另設(shè)正常對照組及陽性對照組(環(huán)磷酰胺50 mg/kg腹腔注射1次)。藥物均用15%丙二醇配制，以0.2 ml/10 g體重尾靜脈注射。給藥后24 h處死小鼠，取股骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa染色。觀察計數(shù)1 000個嗜多染紅細(xì)胞含有微核細(xì)胞數(shù)(MNPCE)。

1.2.3 哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗 預(yù)試驗:50%細(xì)胞生長抑制試驗:每個培養(yǎng)瓶接種6×104個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，加入5個不同濃度的鹽酸椒苯酮胺，培養(yǎng)48 h，換以新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)9 d后棄液。甲醇冰醋酸固定，Giemsa染色，計數(shù)每瓶集落數(shù)，然后以藥物濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞生長率為縱坐標(biāo)作圖，求得鹽酸椒苯酮胺抑制細(xì)胞生長50%的濃度為8.0 μg/ml，以它作為正式實驗的最高濃度。

正式試驗:實驗設(shè)3個劑量組，終濃度分別為鹽酸椒苯酮胺8、2、0.5 μg/ml，另設(shè)陽性對照組及陰性對照組?；罨到y(tǒng)中所含0.5 ml S9混和液于作用6 h后去除，換新培養(yǎng)甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定3次，制片，空氣干燥，Giemsa染色10 min。每組觀察計數(shù)100個中期細(xì)胞分裂相，觀察并記錄染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)情況畸變。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸椒苯酮胺的Ames試驗 見表1。從表中可以看出不論加與不加S9混合物，各陽性誘變劑回變菌落數(shù)均超過空白對照組2倍;鹽酸椒苯酮胺每皿濃度為100和1 000 μg時，對4菌株均有抑菌毒性，其余各劑量組均在正常范圍內(nèi)波動，故判定鹽酸椒苯酮胺的Ames試驗結(jié)果為陰性。

表1 鹽酸椒苯酮胺Ames試驗結(jié)果(±s，n=2)回變菌落數(shù)/皿

表1 鹽酸椒苯酮胺Ames試驗結(jié)果(±s，n=2)回變菌落數(shù)/皿

藥物(μg/皿) TA 97TA 98TA 100TA 102－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9 216±6 242±5 27±0 38±6 143±0 157±10 353±10 578±20 0.1 205±1 218±10 22±6 38±6 137±20 177±13 336±23 387±15 1 215±2 242±10 21±0 36±2 171±7 178±8 353±13 539±5 5 150±5 203±7 16±1 22±4 218±0 189±1 139±5 362±8 10 182±14 232±2 － 42±6 134±9 193±13 75±19 407±0 20 123±8 16±1 110±0 165±3 － 359±1 100 1 000 9-芴酮 0.2 983±10 2，7-2AF 20 509±20 2AF 10 1 736±509 1 360±40 DMC 20 1 440±0 MMS 2.0 μl 6 740±370 1 606±48 PPTA 0 Vp16 1.0 mg 1 270±37

2.2 鹽酸椒苯酮胺的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 見表2。從表中可以看出環(huán)磷酰胺陽性組與對照組相比較，微核率顯著增高(P＜0.001)，而各給藥組的微核率分別與對照組相比較，無顯著性差異(P＞0.05)。說明鹽酸椒苯酮胺的小鼠骨髓微核試驗結(jié)果為陰性。

2.3 鹽酸椒苯酮胺對CHL細(xì)胞染色體試驗 結(jié)果見表3。從表中看出，陽性藥組與對照組比較，畸變率明顯升高，具有極顯著差異(P＜0.001)。而鹽酸椒苯酮胺各劑量組對CHL細(xì)胞染色體的畸變率與對照組相似，均在正常范圍。表明鹽酸椒苯酮胺對CHL細(xì)胞染色體的畸變率在正常范圍內(nèi)，故試驗結(jié)果為陰性。

表2 鹽酸椒苯酮胺的微核試驗結(jié)果(±s)

表2 鹽酸椒苯酮胺的微核試驗結(jié)果(±s)

藥物 n 微核率(‰) P/N P值6 1.66±0.67 40/60鹽酸椒苯酮胺14.5 mg/kg 6 1.17±0.31 36/64 ＞0.05 29.0 mg/kg 6 0.83±0.31 42/58 ＞0.05 58.5 mg/kg 6 1.00±0.37 35/65 ＞0.05環(huán)磷酰胺15%丙二醇50.0 mg/kg 6 38.20±3.00 30/70 ＜0.001

表3 鹽酸椒苯酮胺的染色體畸變試驗結(jié)果

3 討論

PPTA是中國自主研發(fā)的鈣增敏劑類強(qiáng)心藥及心肌保護(hù)劑，具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)，藥物物質(zhì)及其合成工藝、適應(yīng)證、中間體合成工藝、制劑及單晶等5個發(fā)明專利均獲授權(quán)〔5～7〕。目前已完成Ⅰ期臨床試驗，結(jié)果顯示該藥的人體耐受性良好、臨床藥代動力學(xué)特征與臨床前實驗一致。鹽酸椒苯酮胺Ames試驗通過檢測鼠傷寒沙門氏菌回變菌落數(shù)，來推斷鹽酸椒苯酮胺是否存在引起基因突變的遺傳毒性;小鼠微核試驗通過靜脈給予小鼠鹽酸椒苯酮胺后，觀察小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的變化，從而來推斷受試物的致突變性;中國倉鼠肺細(xì)胞染色體畸變通過觀察中國倉鼠肺細(xì)胞染色體形態(tài)、結(jié)構(gòu)及數(shù)量是否改變來推斷鹽酸椒苯酮胺是否存在有引起染色體畸變的遺傳毒性。3項試驗均陰性說明鹽酸椒苯酮胺無致突變作用。

1 楊向陽，李若冰，萬華印.新型鈣增敏劑左西孟旦和鹽酸椒苯酮胺研究進(jìn)展〔J〕.國際藥學(xué)研究雜志，2010;37(1):32-5.

2 萬華印.心血管化學(xué)創(chuàng)新藥鹽酸椒苯酮胺(PPTA)〔EB/OL〕.(2004206230)〔2009208201〕.

3 李茹冰，萬華印，鄧鳳君，等.心血管創(chuàng)新藥鹽酸椒苯酮胺//中國藥理學(xué)會藥學(xué)監(jiān)護(hù)專業(yè)委員會第一屆第四次學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編〔C〕.北京:中國藥理學(xué)會，2008:44.

4 牟 英，孟志云，竇桂芳.椒苯酮胺在比格犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究〔J〕.中國血液流變學(xué)雜志，2006;16(3):338-40.

5 萬華印，李茹冰，周力踐.椒苯酮胺、椒苯酮胺鹽及其制備方法:中國，ZL 02125318.8〔P〕.2004209201.

6 萬華印，李茹冰，周力踐.椒苯酮胺或其鹽用作制備治療心血管疾病藥物的應(yīng)用:中國，ZL02125316.1〔P〕.2005206215.

7 萬華印，李茹冰，周力踐.N-甲基胡椒乙胺鹽的制備方法:中國，ZL 02125317.X〔P〕.2004209215.