江志杰，高春(北京市藥品檢驗所，北京 100035)

眼用制劑是直接用于眼部發(fā)揮治療作用的制劑，而市場上銷售的眼用制劑多為多劑量包裝，需要加入抑菌劑以保證產(chǎn)品的正常貯藏和使用，避免微生物生長與繁殖[1]。玻璃酸鈉滴眼液可以潤滑眼表面，改善其刺激癥狀，如干澀感和異物感，具有潤滑和保濕作用[2]，主要用于干燥綜合征、斯-約二氏綜合征和干眼綜合征等內(nèi)因性疾患，或是手術(shù)后、藥物性、外傷、佩戴隱形眼鏡等外因性疾患。在治療的過程中，玻璃酸鈉滴眼液需要反復(fù)打開使用，這就需要建立良好的防腐體系，以保證產(chǎn)品的微生物安全性，否則，環(huán)境中的微生物一旦大量侵入，有可能破壞產(chǎn)品的品質(zhì)或是對人體造成直接的感染，損害消費者的健康。本實驗按照中國藥典2010年版二部附錄[3]中的抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則對 3個廠家的玻璃酸鈉滴眼液的抑菌效力進行了評價，驗證了產(chǎn)品中抑菌劑的效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HF safe-1200A2生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；SPX-205B-E生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；XG1高壓蒸汽滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；JJ5000電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]均購自中國食品藥品檢定研究院，菌株傳代數(shù)均為第3代。

1.3 樣品

樣品信息見表1。

表1 樣品的信息Tab 1 The information of samples

1.4 培養(yǎng)基

胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，均按照中國藥典2010年版二部附錄要求配制，培養(yǎng)基適用性檢查實驗結(jié)果符合藥典要求。

2 方法

2.1 菌液的制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10 mL胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10 mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)24 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50~100 cfu的菌懸液用于方法學(xué)驗證。上述培養(yǎng)物，用離心法收集菌體，并用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗和制備菌液，采用比濁法制成每1 mL含菌數(shù)約為107cfu的菌懸液用于抑菌效力試驗。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)7 d，加入3 mL含0.05%聚山梨酯 80的 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。過濾菌絲吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數(shù)50~100 cfu的孢子懸液用于方法學(xué)驗證。加入適量的含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，采用比濁法制成每1 mL含孢子數(shù)107cfu的孢子懸液用于抑菌效力試驗。

2.2 供試液的制備

取本品30 mL，混勻，即為供試液。

2.3 菌落計數(shù)方法驗證

2.3.1 菌液組 分別取菌液1 mL，采用平皿計數(shù)法，測定上述制備好的菌液中每毫升的活菌數(shù)，結(jié)果為A。

2.3.2 樣品對照組 取供試液1 mL，等量分注于5個平皿中， 每皿0.2 mL，測定供試品本底的細(xì)菌數(shù)；取供試液1 mL，注入平皿中，測定供試品本底的霉菌和酵母菌數(shù)，結(jié)果為B。

2.3.3 試驗組 取供試液0.2 mL和上述細(xì)菌菌液1 mL(50~100 cfu試驗菌)，分別注入同一平皿中，測定細(xì)菌數(shù)；取供試液1 mL和上述真菌菌液1 mL(50~100 cfu 試驗菌)，分別注入同一平皿中，測定霉菌和酵母菌數(shù)，結(jié)果為C。

2.3.4 回收率的計算 回收率(%)=(菌落數(shù) C-菌落數(shù)B)/菌數(shù)A×100%。

2.4 抑菌效力試驗

2.4.1 樣品組 取 5個無菌玻璃試管，分別加入供試液30 mL，然后分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、黑曲霉和白色念珠菌，使其最終細(xì)菌濃度為106cfu·mL-1，酵母菌和霉菌為105cfu·mL-1，接種菌液的體積為供試品體積的1%，即0.1 mL，充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布，在試驗期間置23 ℃，避光貯存。

2.4.2 菌液組 取 5個無菌玻璃試管，分別加入0.9%氯化鈉溶液 30 mL，然后分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、黑曲霉和白色念珠菌，使其最終細(xì)菌濃度為106cfu·mL-1，酵母菌和霉菌為105cfu·mL-1，接種菌液的體積為供試品體積的1%，即0.1 mL，充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1∶10、1∶100、1∶1 000等稀釋級，分別吸取適宜的稀釋級1 mL，注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置相應(yīng)溫度培養(yǎng)，觀察結(jié)果，根據(jù)測定結(jié)果，計算出1 mL供試品各試驗菌所加的菌數(shù)。

2.4.3 存活菌數(shù)測定 在剛接種(0時)和 7，14，28 d分別從上述試管中取樣品1 mL，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成 1∶10、1∶100、1∶1 000等稀釋級。樣品組按上述驗證的檢驗方法進行細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)。根據(jù)測定結(jié)果，計算各間隔時間的菌數(shù)，并換算成l g值。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法驗證結(jié)果

按照中國藥典2010年版二部附錄要求，采用常規(guī)法進行預(yù)檢驗，結(jié)果顯示樣品A、B和C，除黑曲霉和白色念珠菌外，其他驗證菌株的回收率均<70%，說明樣品A、B和C本身對真菌沒有抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，而對細(xì)菌有一定得抑菌作用，因此采用培養(yǎng)基稀釋法(每皿0.2 mL)進行細(xì)菌計數(shù)驗證，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，采用培養(yǎng)基稀釋法，3次獨立實驗的結(jié)果顯示，樣品A、B和C的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的回收率均>70%，黑曲霉和白色念珠菌采用常規(guī)法，回收率均>70%，因此細(xì)菌、霉菌和酵母菌的計數(shù)方法確定為(樣品A、B和C的菌落計數(shù)方法一樣)：取本品30 mL，混勻，即為供試液；細(xì)菌計數(shù)，取供試液1 mL，等量分注于5個平皿中，每皿0.2 mL，傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，待凝固后，置33 ℃培養(yǎng)3 d逐日觀察結(jié)果；霉菌和酵母菌計數(shù)，取供試液1 mL，注入平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置25 ℃培養(yǎng)5 d逐日觀察結(jié)果。

表2 試驗組回收率測定結(jié)果Tab 2 The recovery results of experiment group

3.2 抑菌效力試驗結(jié)果

本品為眼用制劑，根據(jù)中國藥典2010版附錄中的抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則要求應(yīng)屬一類產(chǎn)品。3種供試品，接種細(xì)菌后，菌的濃度均>106cfu·mL-1，黑曲霉和白色念珠菌接種后濃度均>105cfu·mL-1，而且接種菌液的體積為供試品體積的1%，滿足一類產(chǎn)品的要求。結(jié)果見表3。

由表3可知，3種玻璃酸鈉滴眼液的抑菌作用還是比較明顯，尤其是對金黃色葡萄球菌，14 d和28 d后5種試驗菌株的菌數(shù)均<10 cfu；3種樣品的殺菌作用非常強，與菌液組相比，0時，A、B、C樣品的金黃色葡萄球菌的菌數(shù)lg值分別下降下降0.5，0.3和5；銅綠假單胞菌的菌數(shù)lg值分別下降1.5，3.8和2.8；大腸埃希菌的菌數(shù)lg值分別下降0.6，2和0.4；黑曲霉的菌數(shù)lg值分別下降0，0.3和0；白色念珠菌的菌數(shù)lg值分別下降0.1，0.1和 0。與初始值(剛加入菌液時菌數(shù)的 lg值)相比，7，14，28 d后的各菌lg下降值見表4。

中國藥典2010年版附錄中的抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則中指出一類產(chǎn)品抑菌劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)菌，與初始值比，7 d菌數(shù)lg值下降≥1.0，14 d菌數(shù)lg值下降≥3.0，14 d到28 d菌數(shù)不增加；真菌，與初始值比，7，14，28 d菌數(shù)均不增加。

由表4結(jié)果來看，3個樣品的細(xì)菌數(shù)，與初始值比，除了樣品B的銅綠假單胞菌和樣品C的金黃色葡萄球菌(樣品B的銅綠假單胞菌的初始值只有2.5，而樣品C的金黃色葡萄球菌的初始值為0)外，7 d菌數(shù)lg值均下降>1.0，14 d菌數(shù)lg值下降均>3.0；由于樣品B的銅綠假單胞菌lg值的初始為2.5，7，14及28 d的lg值均為0，該結(jié)果說明樣品 B中的抑菌效力較強，所加入的銅綠假單胞菌在與樣品一接觸時就被殺死了很多，在接觸7 d后所有菌全部被殺滅，其對該菌的抑菌效力是符合要求的。同理樣品 C對金黃色葡萄球菌抑菌效力也是符合要求的。3個樣品的霉菌數(shù)，與初始值比，7，14，28 d菌數(shù)均未增加，由此可以看出3個廠家產(chǎn)品的抑菌效力均滿足藥典要求。

表4 與初始值(0時菌數(shù)lg值)相比下降的lg值Tab 4 The decline bacterial counts lg value compared with the initial value

4 討論

防腐效能試驗無論是對消費者還是生產(chǎn)企業(yè)都至關(guān)重要，防腐劑的量添加過少，會使微生物繁殖而引起污染，防腐劑的量過大，會引起許多不適作用或過敏等病態(tài)反應(yīng)，因此，適量添加防腐劑就顯得尤為重要[4]，添加最少的抑菌劑，而又能保證其樣品的抑菌效力是最科學(xué)的。中國藥典2005年版及以前，國內(nèi)對眼用制劑抑菌劑含量測定沒有具體要求，也沒有要求評價抑菌效果[1]，但USP[5]和 CTFA[6]均收載具體的方法，中國藥典2010年版也收載了抑菌劑效力檢查法的指導(dǎo)原則。

本試驗考察了 3個廠家的玻璃酸鈉滴眼液的抑菌效力，結(jié)果顯示均符合藥典的要求，它們的抑菌試驗結(jié)果顯示，有些0時或7 d的菌數(shù)下降至<1 cfu·mL-1，會不會存在抑菌劑濃度過高的問題有待于進一步研究。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，測定供試品剛接種(0時)菌數(shù)有點難把握，因為要是測定的時間過長，加入的試驗菌株有可能被抑菌劑殺滅，而藥典沒有具體規(guī)定多長時間內(nèi)測定完，而且藥典規(guī)定初始值為 0時供試品剛接種，而標(biāo)準(zhǔn)又要求細(xì)菌7，14 d下降一定的lg值，如果剛接種就被完全殺滅，數(shù)字上就沒法滿足標(biāo)準(zhǔn)，建議將判斷標(biāo)準(zhǔn)加以說明，如果將加入樣品內(nèi)的菌數(shù)作為初始值(0時)，又不能反映供試品初始狀態(tài)下的抑菌效力，失去了判斷抑菌劑濃度是否過高的意義。

[1]ZHANG S L, BAI R W, LI J, et al. Determination of preservative effect on naphazoline hydrochloride and chlorphenamine maleate and vitamin B12 eye drops [J]. Food Drug(食品與藥品), 2011, 13(1): 42-44.

[2]CHEN Y Z, ZHAO X Q, ZHANG M L, et al. Effect of hyaluronate eye drops combined with houttuynia cordata eye drops on the treatment of dry eye [J]. Int J Ophthal(國際眼科雜志), 2011, 11(4): 704-705.

[3]Ch.P(2010)Vol Ⅱ(中國藥典 2010年版. 二部)[S]. 2010:Appendix XIX N.

[4]NIU Z D, JIANG Z J, ZHANG G H, et al. Evaluation of the effect of preservatives in cosmetic with microbial challenge test [J]. Detergent & Cosmetics(日用化學(xué)品科學(xué)), 2012,35(3): 36-38.

[5]SUTTON S V, PORTER D. Development of the antimicrobial effectiveness test as USP chapter(51)[J]. PDA J Pharm Sci Technol, 2002, 56(6): 300- 311.

[6]CIVETTA J M. CTFAs preservation guidelines: a histories perspective and review [J]. Cosmetics and Toiletries, 1993,108: 53-59.