■ 王雪艷 王乙茹 黃遵錫 陳德近 何 雪 安清聰 程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南昆明 650201；2.達州職業(yè)技術(shù)學院，四川達州 635001；3.云南師范大學生命科學學院，云南昆明 650222；4.愛科特生物工程(昆明)有限公司，云南昆明 650506）

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans），是芽孢桿菌屬、乳酸菌類益生菌[1-3]。很多研究表明，飼用凝結(jié)芽孢桿菌改善畜禽生產(chǎn)性能的作用效果具有明顯的劑量效應，即與飼糧中凝結(jié)芽孢桿菌的添加菌數(shù)相關(guān)[4-8]。因此，飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的菌數(shù)檢測真實性和準確性，備受生產(chǎn)企業(yè)及應用企業(yè)的關(guān)注[9]。當前，我國飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的菌數(shù)檢測方法標準主要有《飼料添加劑 凝結(jié)芽孢桿菌的測定（T/YNBX 024—2021）》（云南省標準化協(xié)會頒布，簡稱“云南團標”）[10]、《飼料添加劑 凝結(jié)芽孢桿菌（T/CSWSL 022—2020）》（北京生物飼料產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟頒布，簡稱“北京團標”）[11]，對菌數(shù)檢測均采用了平板計數(shù)法，其檢測原理是將凝結(jié)芽孢桿菌接種到特定培養(yǎng)基，在最佳的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間觀測培養(yǎng)基上單個菌體細胞長成的菌落[9]，并以特征菌落數(shù)量、個體大小、分散程度等指標進行平板計數(shù)[12]。由此可見，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間是準確檢測飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的關(guān)鍵。

然而，云南團標采用的培養(yǎng)條件為“低溫長時間”（40 ℃/48 h）[10]，北京團標采用的培養(yǎng)條件為“高溫短時間”（50 ℃/24 h）[11]，以上2 個標準中培養(yǎng)條件的較大差異不利于生產(chǎn)企業(yè)及應用企業(yè)判定飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的質(zhì)量[9]。據(jù)此，本試驗研究了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間對凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測結(jié)果的影響，為進一步規(guī)范飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑菌數(shù)檢測方法提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料鑒定及制備

飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑（購買原粉標識500 億CFU/g）由愛科特生物工程（昆明）有限公司提供。樣品涂板培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。然后，挑取單菌落用改良MRS 培養(yǎng)基擴培[13-14]，經(jīng)16S rRNA 基因測序及比對，確定為凝結(jié)芽孢桿菌。

隨后，將原粉（A 樣品）用淀粉稀釋5 倍（B 樣品）、25倍（C樣品），制備成3個樣品，用于本次方法學研究。

1.2 培養(yǎng)基

云南團標培養(yǎng)基成分：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、牛肉膏5.0 g、葡萄糖5.0 g（無需分開滅菌）、番茄粉0.5 g、氯化鈉2.5 g、無水氯化鈣0.15 g、水合硫酸錳0.1 g、瓊脂粉25.0 g、蒸餾水1 000 mL、配置好后調(diào)節(jié)pH為5.2[10]。

北京團標培養(yǎng)基成分：大豆蛋白胨5.0 g、酵母粉2.0 g、L-半胱氨酸0.25 g、葡萄糖5.0 g、乙酸鈉2.5 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸錳0.1 g、硫酸鎂0.025 g、溴甲酚紫0.032 g、瓊脂粉20.0 g、蒸餾水1 000 mL 配置好后調(diào)節(jié)pH為5.5[11]。

1.3 試驗設(shè)計

基于云南團標[10]、北京團標[11]中凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間差異，試驗設(shè)計如下：

云南團標檢測試驗的4 個培養(yǎng)條件處理組為：TC40℃/24h組（40 ℃/24 h 低溫、短時培養(yǎng)）、TC40℃/48h組（40 ℃/48 h 低溫、長時培養(yǎng)）、TC50℃/24h組（50 ℃/24 h高溫、短時培養(yǎng)）、TC50℃/48h組（50 ℃/48 h 高溫、長時培養(yǎng)）。

北京團標檢測試驗的4 個培養(yǎng)條件處理組為SC40℃/24h組（40 ℃/24 h 低溫、短時培養(yǎng)）、SC40℃/48h組（40 ℃/48 h 低溫、長時培養(yǎng)）、SC50℃/24h組（50 ℃/24 h高溫、短時培養(yǎng)）、SC50℃/48h組（50 ℃/48 h 高溫、長時培養(yǎng)）。

用平板計數(shù)法開展8 個處理組、3 個樣品的菌數(shù)檢測，并進行菌數(shù)比較分析。

1.4 檢測步驟

1.4.1 取樣及樣品菌懸液制備

3個樣品各精確稱取1.000 g，分別轉(zhuǎn)入裝有100 mL稀釋液的錐形瓶（錐形瓶及內(nèi)置的5 mm 玻璃珠，已滅菌處理），置于搖床震蕩30 min，制備成10-2的樣品菌懸液。

1.4.2 梯度稀釋

吸取樣品菌懸液0.8 mL 至裝有7.2 mL 稀釋液的EP 管中稀釋，并重復這一操作3～7 次，進行逐級梯度稀釋，至3 個樣品的檢測“所需稀釋度”（平板上30～300個可計數(shù)菌落）[9]，樣品A、B、C稀釋度分別為10-8、10-7、10-6。

1.4.3 培養(yǎng)與計數(shù)

1.4.3.1 培養(yǎng)

① 云南團體標準檢測（T/YNBX 024—2021）

從“所需稀釋度”菌懸液的EP 管吸取100 μL，用涂布器在培養(yǎng)基平板上均勻涂布，所用培養(yǎng)基參考云南團體標準。按“所需稀釋度”的菌液，涂布6 個平板。從6 個平板中隨機取3 個平板，于40 ℃培養(yǎng)24 h后檢測菌數(shù)，記錄為“TC40℃/24h”組的菌數(shù)；隨后，在40 ℃延長培養(yǎng)至48 h，記錄為“TC40℃/48h”組的菌數(shù)。

余下3 個平板于50 ℃培養(yǎng)24 h 后檢測菌數(shù)，記錄為“TC50℃/24h”組的菌數(shù)；隨后，在50 ℃延長培養(yǎng)至48 h，記錄為“TC50℃/48h”組的菌數(shù)。

② 北京團體標準檢測（T/CSWSL 022—2020）

按照北京團體標準的檢測步驟，將“所需稀釋度”菌懸液的EP 管放于80 ℃水浴處理10 min 后，再進行菌數(shù)檢測[9]。

從熱處理后的EP 管中吸取100 μL 菌懸液，用涂布器在培養(yǎng)基平板上均勻涂布，所用培養(yǎng)基參考北京團體標準。按“所需稀釋度”的菌液，涂布6 個平板。從6個平板中隨機取3個平板，于40 ℃培養(yǎng)24 h后檢測菌數(shù)，記錄為“SC40℃/24h”組的菌數(shù)；隨后，在40 ℃延長培養(yǎng)至48 h，記錄為“SC40℃/48h”組的菌數(shù)。

余下3 個平板于50 ℃培養(yǎng)24 h 后檢測菌數(shù)，記錄為“SC50℃/24h”組的菌數(shù)；隨后，在50 ℃延長培養(yǎng)至48 h，記錄為“SC50℃/48h”組的菌數(shù)。

1.4.3.2 計數(shù)

菌數(shù)計數(shù)參照云南團標中“6.3.3.1 活菌含量計算式”進行[10]。

1.5 統(tǒng)計分析

菌數(shù)檢測值用“平均值±標準差”表示，并進行單因素方差分析。用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 樣品菌株鑒定

樣品菌落形態(tài)見圖1（A），16S rRNA 測序所得菌株的基因序列在NCBI 中經(jīng)Blast 比對，與Weizmannia coagulansMT604642 相似度高達99.93%。2022 年8月，國家衛(wèi)健委第4 號公告，依據(jù)國際微生物菌株的重新命名，已經(jīng)將凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）更名為凝結(jié)魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans），并在我國設(shè)置兩年過渡期?；蛐蛄袠?gòu)建的發(fā)育樹見圖1（B），序列與凝結(jié)芽孢桿菌聚為一簇，鑒定該樣品菌株為凝結(jié)芽孢桿菌。

2.2 云南團標檢測步驟的培養(yǎng)溫度、時間對飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響

云南團體標準檢測3個樣品中凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的結(jié)果見表1，3個樣品的TC50℃/24h（50 ℃/24 h培養(yǎng)）組菌數(shù)與TC50℃/48h（50 ℃/48 h培養(yǎng)）組完全一致，均顯著高于TC40℃/48h（40 ℃/48 h 培養(yǎng)）組（P＜0.05)，圖2 顯示，TC50℃/24h平 板 菌 落 比TC40℃/48h密 集，且 同 一 視 野 下TC50℃/48h組平板上的菌落明顯大于培養(yǎng)時間較短的TC50℃/24h組。此外，表1和圖2顯示TC40℃/24h（40 ℃/24 h培養(yǎng)）組平板上無菌落生長，因此無菌數(shù)計數(shù)數(shù)據(jù)。

表1 培養(yǎng)溫度、時間對凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響（云南團標檢測步驟，億CFU/g)

圖2 培養(yǎng)溫度、時間對凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響（菌落形態(tài)，云南團標檢測）

2.3 北京團標檢測步驟的培養(yǎng)溫度、時間對飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響

北京團體標準檢測3 個樣品中凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的結(jié)果如下見表2，3 個樣品的SC50℃/24h（50 ℃/24 h培養(yǎng)）組菌數(shù)與SC50℃/48h（50 ℃/48 h 培養(yǎng)）完全一致，均顯著高于SC40℃/48h（40 ℃/48 h 培養(yǎng)）組（P＜0.05）。如圖3所示，北京團體標準的平板培養(yǎng)基為淺黃綠色，與云南團體標準的平板培養(yǎng)基明顯不同，且SC50℃/24h組平板菌落比SC40℃/48h組密集；同一視野下SC50℃/48h組平板上的菌落明顯大于培養(yǎng)時間較短的SC50℃/24h組。此外，表2 和圖3 顯示SC40℃/24h（40 ℃/24 h 培養(yǎng)）組平板上無菌落生長，因此無菌數(shù)計數(shù)數(shù)據(jù)。

表2 培養(yǎng)溫度、時間對凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響（北京團標檢測步驟，億CFU/g）

圖3 培養(yǎng)溫度、時間對凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響（菌落形態(tài)，北京團標檢測）

2.4 云南團體標準與北京團體標準檢測凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的比較

由表3 可知，在50 ℃培養(yǎng)24 h 或48 h，TC50℃/24h組樣品B 和樣品C 菌數(shù)均顯著高于SC50℃/24h組（P＜0.05）。此外，TC40℃/48h組的樣品A 和樣品C 菌數(shù)均顯著高于SC40℃/48h組（P＜0.05）。

表3 云南團標與北京團標檢測凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的比較

3 討論

眾所周知，適宜的溫度、水分、營養(yǎng)等是細菌繁殖與生長的基本條件，因此最佳的培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間成為細菌菌數(shù)平板計數(shù)法的關(guān)鍵條件[9]?；谠颇蠄F標“低溫、長時”（40 ℃/48 h）與北京團標“高溫、短時”（50 ℃/24 h）的培養(yǎng)條件差異，本研究設(shè)置了“低溫、長時”（40 ℃/48 h）、“低溫、短時”（40 ℃/24 h）、“高溫、長時”（50 ℃/48 h）、“高溫、短時”（50 ℃/24 h）四個培養(yǎng)條件，分別按云南團標、北京團標的檢測步驟，對不同含量的3 個飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑樣品進行了平板計數(shù)研究。數(shù)據(jù)顯示，50 ℃/24 h 培養(yǎng)的凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)顯著高于40 ℃/48 h 培養(yǎng)的菌數(shù)（TC50℃/24h＞TC40℃/48h；SC50℃/24h＞SC40℃/48h），且40 ℃/24 h 培養(yǎng)的平板上(TC40℃/24h和SC40℃/24h)無菌落生長，無法檢測計數(shù)。進一步觀察平板上凝結(jié)芽孢桿菌的菌落數(shù)量、個體大小、分散程度，發(fā)現(xiàn)無論采用云南團標操作步驟還是北京團標操作步驟，50 ℃/24 h 培養(yǎng)得檢出菌數(shù)與50 ℃/48 h 培養(yǎng)的完全一致，區(qū)別在于同一視野下觀察50 ℃/48 h 培養(yǎng)的菌落個體明顯大于50 ℃/24 h的菌落。以上結(jié)果表明，平板計數(shù)法檢測飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的適宜培養(yǎng)溫度為50 ℃、培養(yǎng)時間為24～48 h。

此外，表3 結(jié)果顯示50 ℃/24 h 或50 ℃/48 h 培養(yǎng)條件下，3 個凝結(jié)芽孢桿菌樣品采用云南團標操作的檢出菌數(shù)比北京團標的檢出菌數(shù)高7.89%～8.14%，且B、C 組整體差異顯著。原因分析如下：其一，總菌數(shù)（total aerobic count, TC）與芽孢數(shù)（spore count, SC）的檢測差異。凝結(jié)芽孢桿菌為芽孢桿菌屬益生菌，因此飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑中普遍存在芽孢、活菌等多種狀態(tài)的細菌[1，9，17]。北京團標的檢測步驟將樣品80 ℃/10 min 熱處理后進行菌數(shù)檢測[11]，而云南團標檢測步驟未對樣品熱處理[10]。董佩佩等[16]、嚴濤等[17]、單春喬等[18]認為80 ℃/10 min 熱處理是芽孢桿菌屬益生菌制劑中芽孢數(shù)檢測的規(guī)范方法，因為有效去除了制劑中的活菌《飼料中飼用芽孢桿菌的測定（DB 32/T 2583—2013）》[19]。據(jù)此，北京團標實測的是飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的芽孢數(shù)，而云南團標實測的是飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的總菌數(shù)（包括芽孢和活菌），兩者在概念及檢出值上有明顯區(qū)別和差異[9]。其二，培養(yǎng)基差異。有綜述文章顯示[9]，云南團標培養(yǎng)基與北京團標培養(yǎng)基的營養(yǎng)組分及含量有明顯差異，而營養(yǎng)底物是影響細菌生長的重要條件[20-21]，因此可能影響菌數(shù)檢出結(jié)果，這也在本試驗圖2、圖3 的培養(yǎng)基顏色、菌落大小等差異上直觀印證。誠然，這一推測有待進一步試驗的科學數(shù)據(jù)驗證。

4 結(jié)論

研究證明，平板計數(shù)法檢測飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的適宜培養(yǎng)溫度為50 ℃、培養(yǎng)時間為24～48 h。此外，通過對比檢出菌數(shù)，分析出北京團標實測的是飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的芽孢數(shù)，而云南團標實測了飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的總菌數(shù)。本研究為規(guī)范飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)平板計數(shù)法的操作提供科學依據(jù)，為飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑生產(chǎn)企業(yè)及應用企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)檢提供借鑒。