李通，金彩霞，朱雯斐，劉國光，劉海津，鄭立慶

河南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院 河南省環(huán)境污染控制重點實驗室黃淮水環(huán)境與污染防治教育部重點實驗室，新鄉(xiāng)453007

隨著我國大中城市和鄉(xiāng)鎮(zhèn)集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)的 迅速發(fā)展，含有各種獸藥抗生素的畜禽糞便的年產(chǎn)出量在不斷增加。大量的畜禽糞便排放是構(gòu)成我國抗生素面源污染的主要原因之一。然而，研究表明，抗生素類藥物只有15%可被吸收利用，大約85%未被代謝而被直接排放到環(huán)境中，導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境中檢測出的獸藥種類和濃度逐年增加［1］。2002年Campagnolo等［2］在豬和家禽大型養(yǎng)殖廠儲便池中檢測到多種畜用抗生素(濃度＞100μg·L-1)，并在其附近的地表水及地下水中檢測到ng·L-1水平的同類抗生素。隨著獸藥的大量使用，其在環(huán)境中的累積濃度亦在增加，Hamscher等［3］報道，在施用廄肥的土壤表層，檢測到了土霉素和金霉素的殘留，其最大濃度竟分別高達(dá)32．3和26．4 mg·kg-1。絕大多數(shù)抗生素以原藥或代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)動物的糞尿排出，通過一定的途徑進(jìn)入農(nóng)田，使作物的生存環(huán)境發(fā)生變化，對植物的生長發(fā)育造成不同的影響。僅有的研究表明，施用動物糞肥和污泥后，作物產(chǎn)量降低。這除了與氮和重金屬的過度施用有關(guān)外，在某種情況下也與糞肥和污泥中的獸藥殘留有關(guān)［4］。植物不同組織對污染物毒性反應(yīng)不同，根系和葉是植物體內(nèi)污染物主要的蓄積場所，它們對污染物的反應(yīng)較明顯。對農(nóng)作物而言，獸藥殘留對植物的危害有兩種情況［5］，一是反映在農(nóng)作物減產(chǎn)或品質(zhì)降低;二是反映在可食部分有毒物質(zhì)積累量已超過允許限量，但農(nóng)作物產(chǎn)量卻沒有明顯下降或不受影響。藥物對植物生長發(fā)育的影響取決于藥物的類型和劑量，藥物與土壤吸附能力及其在土壤中的穩(wěn)定性，同時藥物對作物的影響還隨藥物和植物的品種不同而不同。土霉素和氯四環(huán)素對雜色豆的生長有明顯的抑制作用，具體表現(xiàn)為:植株的生節(jié)、鮮質(zhì)量下降，并影響植物對鈣、鉀和鎂等離子的吸收。土霉素和氯四環(huán)素能促進(jìn)蘿卜和小麥的生長，但對玉米的生長卻沒有影響［6］。目前，國內(nèi)外關(guān)于有機農(nóng)藥和重金屬污染土壤對植物生長發(fā)育影響的報道很多，而針對獸藥在土壤中殘留及其對植物的毒性作用方面的研究卻鮮有報道，因此急需開展相關(guān)方面的研究。

目前已建立的高等植物毒理實驗方法主要有3種:根伸長實驗、種子發(fā)芽實驗和植物幼苗早期生長實驗［7-9］。雖然有關(guān)用這些方法進(jìn)行土壤污染現(xiàn)場修復(fù)以及土壤生物修復(fù)過程的污染診斷研究已有較多報道［10-11］，但目前針對此法探究抗生素獸藥殘留污染開展的毒理學(xué)實驗還較少，因此，有必要展開相關(guān)方面的研究。

通過研究環(huán)丙沙星對玉米、白菜、蘿卜種子發(fā)芽、根伸長和芽伸長的影響，旨在揭示環(huán)丙沙星的毒性效應(yīng)，以及可能對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來的生態(tài)風(fēng)險。

1 材料與方法(M aterials and methods)

1．1 實驗材料

供試藥品:環(huán)丙沙星鹽酸鹽一水合物，純度﹥98%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

供試種子和土壤:小白菜(Brassica chinensis L．，品種為上海青)，發(fā)芽率為98%;蘿卜(Raphanus Sativus L．，盛豐二號)，發(fā)芽率80%;玉米(Zeamays L．，鄭單958)，發(fā)芽率為98%。以上3種種子均購自新鄉(xiāng)市種子公司。供試土壤采自河南師范大學(xué)校內(nèi)生物實驗田0～20 cm表土。

1．2 實驗方法

用甲醇配置250 mg·L-1的環(huán)丙沙星母液，然后依次根據(jù)需要配成不同濃度的環(huán)丙沙星水溶液。稱取50 g風(fēng)干土壤于90 mm直徑的玻璃培養(yǎng)皿中，分別加入不同濃度的環(huán)丙沙星水溶液5mL，攪拌均勻，并用去離子水調(diào)節(jié)土壤含水量至田間最大持水量的60%，用鑷子將玉米、蘿卜、小白菜種子均勻播種于土壤中(種子放置時，保持種子胚根末端和生長方向呈直線)，蓋好玻璃培養(yǎng)皿，并置于恒溫培養(yǎng)箱中25℃下暗處培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，通過稱量質(zhì)量用去離子水補充蒸發(fā)損失的水分。設(shè)不含環(huán)丙沙星為對照組，同時設(shè)1組未播種種子的空白實驗，以此了解實驗期間內(nèi)，環(huán)境條件對環(huán)丙沙星濃度的影響。當(dāng)對照種子的發(fā)芽率＞90%，根長度為20mm時，結(jié)束實驗。確定種子根和芽伸長抑制濃度，使其抑制率在10% ～70%之間，開始正式實驗，抑制率(IR)按下式計算:

預(yù)實驗結(jié)果顯示，玉米、蘿卜和小白菜的實驗培養(yǎng)天數(shù)較短，且相差不大，均為4～5 d，且提取測定了實驗前后空白土樣中的環(huán)丙沙含量，研究發(fā)現(xiàn)，實驗前后環(huán)丙沙星濃度基本未變化，這表明外界環(huán)境條件(如含水量、暴露時間等)對環(huán)丙沙星濃度的影響可以忽略不計。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，環(huán)丙沙星的處理濃度分別為:玉米為 0．5、1．0、2．0、5．0、10．0 和 20．0 mg·kg-1;蘿卜為0．5、1．0、2．0、3．0 和 5．0 mg·kg-1;小白菜為0．1、0．5、1．0、2．0 和 4．0 mg·kg-1。每個培養(yǎng)皿中放入20粒種子作1次重復(fù)，每個濃度設(shè)3次重復(fù)，同時設(shè)不含環(huán)丙沙星為空白對照組。在與預(yù)實驗相同條件下進(jìn)行作物種子發(fā)芽和生長培養(yǎng)實驗。實驗結(jié)束后，測定各處理濃度下種子的根伸長、芽伸長，計算根長度和芽長度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并繪制濃度-抑制率曲線，進(jìn)行回歸分析，并計算ID50(抑制率為50%時，土壤中環(huán)丙沙星的濃度，mg·kg-1)。

1．3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel2003和Origin 7．5數(shù)據(jù)處理軟件(美國Microcal Software公司)對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及回歸分析，計算出ID50，對劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合并作圖。本實驗差異顯著性水平為P＜0．05。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2．1 環(huán)丙沙星污染對作物種子發(fā)芽、芽伸長和根伸長的影響

作物根伸長、芽伸長與土壤中環(huán)丙沙星濃度的關(guān)系見圖1和表1。由圖1和表1的R2值可知，在土壤受到環(huán)丙沙星污染時，土壤中污染物的含量與上述3種作物的根伸長及芽伸長抑制率顯著相關(guān)(P ＜0．01)，而3種作物(玉米、蘿卜、小白菜)的發(fā)芽抑制率與土壤中環(huán)丙沙星濃度之間不具有相關(guān)性(P ＞0．05)。

表1 環(huán)丙沙星對3種作物生長抑制的回歸方程Table 1 Regression equation of CPFX for inhibitoryrate of growth of three crops

由表1的ID50值可以看出，環(huán)丙沙星對3種作物根伸長的抑制作用都強于對芽伸長的抑制，即在環(huán)丙沙星的脅迫下，上述3種作物的根伸長均較芽伸長敏感。

綜合以上分析可知，相比于其他2個指標(biāo)(芽伸長、發(fā)芽率)，根伸長對環(huán)丙沙星濃度的變化最為敏感，其對環(huán)丙沙星毒性敏感順序依次是:根伸長＞芽伸長 ＞發(fā)芽率，這與宋玉芳等［12］和鮑艷宇等［13］研究的其他污染物對作物的生態(tài)毒性效應(yīng)是相一致的。這可能與種子發(fā)芽和根伸長的生長過程有關(guān)。通常情況下，植物種子發(fā)芽過程除了受外界環(huán)境條件影響外，還可從胚內(nèi)得到養(yǎng)分供應(yīng)，在較低濃度污染物的脅迫下，土壤污染對植物種子發(fā)芽的毒害作用在一定范圍內(nèi)僅表現(xiàn)為部分抑制，只有當(dāng)土壤受到嚴(yán)重污染時，種子發(fā)芽才能完全被抑制，而根從一開始就完全暴露于土壤中，其生長和發(fā)育全過程受外界條件的影響較大，因此，根對土壤污染的反應(yīng)更敏感［12］。

圖1 環(huán)丙沙星對3種作物發(fā)芽(◆)、芽伸長(■)和根伸長(▲)的抑制Fig．1 Effect of ciprofloxacin(CPFX)on seed germination(◆)and elongation of root(■)and shoot(▲)of three crops

另外，由圖1還可以看出，無論是玉米、蘿卜還是小白菜，其芽伸長抑制率與根伸長抑制率之間的差異均隨著環(huán)丙沙星濃度的增大而逐漸減小。當(dāng)土壤中環(huán)丙沙星的濃度為0．5 mg·kg-1時，玉米、蘿卜、小白菜3種作物芽伸長與根伸長抑制率之間差異分別是12．65%、17．75%和 13．86%。然而當(dāng)土壤中環(huán)丙沙星的濃度達(dá)到3種作物各自最高濃度(玉米為20．0 mg·kg-1，蘿卜為 5．0 mg·kg-1，小白菜為 4．0 mg·kg-1)時，環(huán)丙沙星對3種作物根伸長與芽伸長抑制率基本相近，差異非常不顯著，最大相差僅為5．43%。這可能是由于環(huán)丙沙星濃度較高時，土壤污染程度嚴(yán)重，土壤的滲透壓增加，致使部分環(huán)丙沙星滲透到種皮內(nèi)部，從而影響作物生長，這種情況下種皮對芽的保護(hù)作用消失，從而較大程度地抑制了芽的伸長。

2．2 3種作物對環(huán)丙沙星的敏感性比較

目前，經(jīng)常采用植物的ID50來評價污染物的毒性強弱［14］。不同植物對不同污染物的敏感性不同，以此可用于篩選針對不同污染物的敏感性指示植物及用于評價不同藥物的毒性大小，從而可為污染物的安全性評價提供依據(jù)。由表1可知，3種作物在環(huán)丙沙星的脅迫下，其敏感性順序為:小白菜＞蘿卜＞玉米。這可能與藥物的作用機制及作物的吸收機制有關(guān)。抗生素類藥物的對植物的毒性主要是植物體內(nèi)該污染物與葉酸相互競爭的結(jié)果，葉酸與嘌呤合成有關(guān)，而嘌呤是細(xì)胞分裂素和脫落酸的前體，因此植物吸收藥物而降低了對葉酸的吸收從而影響了其正常的生理功能［15］。環(huán)丙沙星可能通過抑制植物體葉酸的合成，從而抑制其生長，進(jìn)而對其根和芽伸長產(chǎn)生了較強的脅迫效應(yīng)，但藥物對植物生長抑制的具體作用機制有待于進(jìn)一步實驗研究。

綜上所述，可以得到以下結(jié)論:

(1)當(dāng)土壤受到環(huán)丙沙星污染時，土壤中環(huán)丙沙星濃度與3種作物(玉米、蘿卜和小白菜)的根伸長和芽伸長抑制率具有相關(guān)性(P ＜0．05)，但與這3種作物種子發(fā)芽抑制率之間不具有相關(guān)性(P ＞0．05)。

(2)作物的發(fā)芽率、根伸長和芽伸長對環(huán)丙沙星的毒性敏感順序依次為:根伸長＞芽伸長＞發(fā)芽率。

(3)從環(huán)丙沙星對玉米、蘿卜和小白菜根伸長的ID50值判斷，3種作物在環(huán)丙沙星的脅迫下，其敏感性順序分別為:小白菜＞蘿卜＞玉米。

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