劉春燕，張 珍，易秋艷，劉艷清，王昕怡，盧 斌，王英之杰，邵加慶

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

銀杏葉提取物EGb761是目前國內(nèi)外治療缺血性心腦血管病中的常用藥物，在對合并糖尿病的心腦血管疾病的臨床和基礎(chǔ)研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)EGb761能顯著改善血糖水平［1-2］、保護(hù)胰島 β 細(xì)胞［3］，這為糖尿病的治療提供了一種新的治療手段，但其防治糖尿病的機(jī)制尚未明確。本研究采用db/db小鼠，通過觀察EGb761干預(yù)對胰島分泌功能和胰島內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶表達(dá)水平的影響，探討EGb761改善糖尿病的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 選取10只8周齡清潔級雄性C57BL/KsJ-db/db小鼠［許可證號SCXX(蘇)2007-0012］，體重約20～25 g，喂養(yǎng)于清潔屏障設(shè)施內(nèi)，環(huán)境溫度保持在23℃，12～12 h亮暗周期，自由攝取食物和飲水。動物的處置均遵循實驗動物看護(hù)原則(NIH Publication No.85-23，修訂于1985年)。

1.2 方法 將10只db/db小鼠隨機(jī)分為觀察組(EGb761組)、糖尿病對照組(db/db組)，每組各5只，分別給予8周的EGb761［GINATON(金納多)，德國的施瓦伯制藥集團(tuán)］，100 mg/(kg·d)和安慰劑(5%阿拉伯膠)灌胃，另選取5只同周齡同窩出生的db/m小鼠作為非糖尿病對照組(db/m組)，給予安慰劑灌胃。

1.3 實驗儀器、材料 血糖儀［One Touch Ultra，強(qiáng)生(中國)醫(yī)療器材有限公司］、血糖試紙(lifescan公司，美國)、光學(xué)顯微鏡(尼康 E800，日本)、豚鼠抗人胰島素抗體(1∶2000，LINCO公司，美國)、山羊抗人 p22phox、gp91phox 抗體(1∶100，Santa Cruz生物技術(shù)公司，加拿大)、生物素化山羊抗豚鼠IgG抗體(1∶1000，Chemicon 公司，加拿大)、生物素化兔抗山羊IgS抗體(1∶200)與生物素化山羊抗小鼠IgS抗體(1∶200，Dako 公司，日本)。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 相關(guān)生理指標(biāo)檢測 每周監(jiān)測小鼠體重和隨機(jī)血糖，投藥前和投藥8周后測定空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FSI)、并計算葡萄糖和胰島素曲線下面積及胰島素敏感指數(shù)。并于投藥8周后，每組的5只小鼠均行腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)。用胰島素曲線下面積(AUCFSI)評價胰島分泌功能，以 0～30 min胰島素曲線下面積(AUCFSI0-30)評價早期相的胰島素分泌，計算公式為：AUCFSI0-30=FSI30-FSI0。

1.4.2 免疫組織化學(xué)測定 投藥8周后，取小鼠胰腺固定、包埋、切片后利用抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物(ABC)法檢測胰島素、NADPH氧化酶p22phox亞基、gp91phox亞基的表達(dá)，按藥盒說明書操作。

1.4.3 胰島測量分析 光學(xué)顯微鏡下觀察切片并拍照，利用Axiovision 4.3軟件獲得數(shù)字照片后用Image-Pro Plus 5.0.1軟件分析，胰島中p22phox和gp91phox的表達(dá)強(qiáng)度分析參照操作說明書。胰島β細(xì)胞含量測定使用胰島素染色照片分析并用下述公式計算：胰島β細(xì)胞含量(mg)=胰島面積/胰腺面積×胰腺重量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，實驗前后的資料比較用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生理指標(biāo) 投藥前，EGb761組和db/db組的體重、血糖無明顯差異(P＞0.05)；投藥8周后兩組體重仍無顯著差異，但EGb761組平均空腹血糖顯著低于db/db組(P＜0.05)，且胰島素敏感指數(shù)明顯升高(P＜0.05，表1)。而db/m組投藥前投藥后各項指標(biāo)均與EGb761組和db/db組有顯著差異(P＜0.05)。

2.2 EGb761對糖耐量及胰腺分泌功能的影響 糖負(fù)荷前及負(fù)荷后60、120 min，EGb761組血糖較db/db組顯著降低，且AUCFSI顯著低于db/db組(P＜0.05，圖1)。糖負(fù)荷后30 min EGb761組血漿胰島素水平升高，且AUCFSI0-30顯著高于db/db組(P＜0.05，表2、圖2)，說明 EGb761對糖耐量的改善部分得益于胰島β細(xì)胞早期相功能的改善。db/m組各項指標(biāo)與EGb761組和db/db組亦有顯著差異(P＜0.05)。

2.3 EGb761對胰島質(zhì)量的影響 與db/m組相比，db/db組的胰腺內(nèi)胰島素染色強(qiáng)度明顯降低，提示胰島質(zhì)量的顯著下降，而EGb761組的胰島素染色強(qiáng)度、胰島β細(xì)胞含量均顯著高于db/db組，介于 db/m組和 db/db組之間(圖 3、4)，表明了EGb761有效減輕了胰腺損傷導(dǎo)致的胰島質(zhì)量下降。

2.4 EGb761對胰腺內(nèi)NADPH氧化酶表達(dá)的影響Gp91phox和 p22phox陽性區(qū)域出現(xiàn)在胰島細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，半定量分析顯示db/db組gp91phox和p22phox表達(dá)最強(qiáng)，EGb761治療顯著降低gp91phox和p22phox表達(dá)強(qiáng)度，并低至接近db/m組水平(P＜0.01，圖5～8)，反映胰島內(nèi)氧化應(yīng)激程度下降。

表1 投藥前及投藥8周后相關(guān)生理指標(biāo)比較()

表1 投藥前及投藥8周后相關(guān)生理指標(biāo)比較()

注：與db/db組比較，*P＜0.05

圖1 葡萄糖耐量試驗血糖曲線

表2 葡萄糖耐量試驗中血糖和胰島素曲線下面積()

表2 葡萄糖耐量試驗中血糖和胰島素曲線下面積()

注：與db/db組比較，*P＜0.05

圖2 葡萄糖耐量試驗胰島素釋放曲線

3 討論

圖3 胰腺胰島素染色(ABC×400)

圖4 胰島組織胰島β細(xì)胞含量

圖5 胰島組織p22phox染色顯示(ABC×400)

圖6 胰島組織p22phox半定量顯示

圖7 胰島組織gp91phox染色顯示(ABC×400)

圖8 胰島組織gp91phox半定量顯示

本研究所選取的15只小鼠是同窩出生的，根據(jù)實驗要求，在進(jìn)入本實驗前其中的10只小鼠已被成功造模成糖尿病鼠(db/db小鼠)，另5只作為非糖尿病對照組(db/m組)也納入本次實驗中。在實驗開始前把10只db/db小鼠隨機(jī)分為兩組，一組給予藥物灌胃作為實驗組(EGb761組)，另一組給予安慰劑灌胃作為糖尿病對照組(db/db組)，5只非糖尿病小鼠給予安慰劑灌胃作為非糖尿病對照組(db/m組)。分組的理論基礎(chǔ)是觀察db/m組與db/db組、EGb761組與db/db組、EGb761組與db/m組之間的體重、隨機(jī)血糖、IPGTT、胰島素敏感性、胰腺內(nèi)NADPH氧化酶等各項指標(biāo)變化，由此分析評估筆者所預(yù)計的實驗結(jié)果以及EGb761可能的降糖機(jī)制。

Guzik等［4］研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶是血管生成活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)的主要酶體，ROS可使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性、生物酶失活、核酸破壞，增強(qiáng)氧化應(yīng)激等作用，本課題組前期研究證實ROS的過度蓄積不僅可以直接損傷胰島β細(xì)胞，還可通過影響胰島素合成和分泌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間接導(dǎo)致β細(xì)胞損傷凋亡，從而損害胰島的分泌功能［5-10］。Gp91phox和p22phox是NADPH氧化酶復(fù)合體的膜結(jié)合亞基，被認(rèn)為是NADPH氧化酶最主要的功能亞基，本研究利用免疫組化證實了gp91phox和p22phox在胰島β細(xì)胞中的表達(dá)，db/db組的表達(dá)強(qiáng)度遠(yuǎn)超過db/m組，而EGb761治療可顯著降低NADPH氧化酶的表達(dá)，證明EGb761通過其強(qiáng)大的抗氧化、清除自由基能力降低小鼠血糖，改善胰島素分泌功能和胰島素敏感性，機(jī)制可能是通過降低氧化應(yīng)激的上游因子如NADPH氧化酶gp91phox、p22phox亞基的表達(dá)水平而改善胰腺微環(huán)境，減輕氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)胰島 β細(xì)胞。但EGb761改善糖尿病的具體機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步加以研究。

銀杏葉作為藥物使用在中國已有很久的歷史，其提取物EGb761作為一種公認(rèn)的強(qiáng)抗氧化劑，已被證實不僅具有清除氧自由基、抑制NO的產(chǎn)生等作用，還能舒張血管平滑肌、降低外周血流阻力、增加局部血流量、改善心腦等器官血液循環(huán)［11-12］。Zhou等［13］證實銀杏內(nèi)酯可拮抗氧化損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，并且可以在凋亡早期阻斷其進(jìn)程。Smith等［14］發(fā)現(xiàn)EGb761能夠維持線粒體膜的完整性，減少線粒體細(xì)胞色素C的釋放，而細(xì)胞色素C正是形成凋亡小體的關(guān)鍵分子。

近年來，隨著研究的不斷深入，糖尿病的治療已經(jīng)超越傳統(tǒng)的促進(jìn)胰島素分泌以及減輕胰島素抵抗上，針對性的抗炎、抗氧化已經(jīng)成為糖尿病治療的熱點，EGb761、大黃酸［15］、鬼針草提取物［16］等都是近年來國內(nèi)學(xué)者研究降糖機(jī)制的對象，中西醫(yī)聯(lián)手，“降”、“調(diào)”結(jié)合，優(yōu)勢互補(bǔ)不失為一條提高全人類健康的新途徑。

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