呂 恒，張錦海，顧海濤，王 平，王長軍，王玉邦

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

腸出血性大腸桿菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)主要包括 O157∶H7、O26∶H11、O111和O104等幾種血清型，其中O157∶H7是典型菌株［1］。該病原菌可引起人腹瀉、出血性腸炎、血栓性血小板減少性紫癜和溶血性尿毒癥。EHEC O157∶H7的感染具有暴發(fā)流行、強致病性、高致死率以及抗生素治療可能加劇病情等特點［2］。因此快速、特異的檢測對于該病的早期診斷及疫情的有效控制至關重要。目前我國EHEC的檢測方法有顯性培養(yǎng)基分離法、免疫磁珠富集、血清凝集等方法。但這些方法存在費時費力、檢測時限長等弊端［3］。

環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術是 Notomi等［4］建立的一種核酸等溫擴增技術，能在等溫條件下高效、快速、靈敏、特異地擴增靶基因。該方法具有靈敏度高、特異性好、反應時間短、判定結(jié)果方便、不需要昂貴儀器等優(yōu)勢，可廣泛用于病毒病、細菌病、寄生蟲病的診斷［5-7］。本研究以 EHEC O157∶H7的編碼脂多糖rfbE基因為靶序列設計引物，建立了優(yōu)化的LAMP檢測技術，并在此基礎上應用金屬離子指示劑羥基萘酚藍(hydroxy naphthol blue，HNB)判定反應結(jié)果，使LAMP的結(jié)果判斷更簡單直觀，可為基層醫(yī)療機構、疫情現(xiàn)場調(diào)查提供快速可視化的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 Loopamp DNA擴增試劑盒、Loopamp LA-320C實時濁度儀(北京藍譜公司)，羥基萘酚藍(HNB)(Sigma公司)，細菌基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA 250bp marker等(大連寶生物公司)，Eppendorf 5415R離心機(德國Eppendorf公司)，BIO-RAD電泳儀(美國Bio-Rod公司)，紫外分光光度計(美國 Thermo Fisher公司)。

1.2 菌株 EHEC O157∶H7，腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸聚集性大腸桿菌(EAEC)、宋內(nèi)志賀菌菌株均由軍事醫(yī)學科學院饋贈；福氏志賀菌由解放軍86醫(yī)院饋贈。

1.3 引物設計與合成 根據(jù)GenBank公布的EHEC O157∶H7的 rfbE基因序列(GenBank：S83460)的保守區(qū)，采用引物設計軟件Primer Explorer 4.0設計LAMP引物及兩條環(huán)引物LF、LB，由南京金斯瑞公司合成。引物序列見表1。

表1 LAMP引物序列

1.4 DNA模板的制備 按照試劑盒說明書，使用TaKaRa通用基因組DNA提取試劑盒分別提取EHEC O157∶H7、ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋內(nèi)志賀菌、福氏志賀菌的基因組DNA。

1.5 LAMP反應體系優(yōu)化

1.5.1 HNB指示劑濃度的優(yōu)化 將HNB加入LAMP反應體系中，HNB在反應前顯紫羅蘭色，發(fā)生LAMP反應即變?yōu)樘焖{色。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道的HNB 用量有 120 μmol/L［8］、150 μmol/L［9］，本研究選擇了120、150和 200 μmol/L 3個濃度進行HNB顯色對比。

1.5.2 配制LAMP反應體系與溫度優(yōu)化 LAMP反應體系總計 25μl，包括：2 × 反應緩沖液 12.5μl，引物混合液 2.5μl(FIP、BIP 各 40 pmol/L，LF、LB各20 pmol/L，F(xiàn)3、B3 各5 pmol/L)，Bst DNA 聚合酶1.0μl，DNA 模板 2μl，HNB 1.0μl(反應濃度 150 μmol/L)，ddH2O 6μl。配制同樣的 6 個反應體系，利用LAMP濁度儀分別于61～65℃溫育60 min，最后80℃滅活2 min。以最早出現(xiàn)波峰，擴增效率最高為標準選擇最佳反應溫度。觀看顏色反應與LAMP濁度儀判讀結(jié)果是否一致，產(chǎn)物于25 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析驗證。

1.6 LAMP快速法與LAMP標準法比較 通過三組試驗，觀察LAMP濁度儀實時擴增曲線、比較體系內(nèi)加環(huán)引物(快速法)與不加環(huán)引物(標準法)對實驗結(jié)果的影響。

1.7 LAMP方法特異性檢測 將提取的EHEC O157∶H7、ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋內(nèi)志賀菌、福氏志賀菌基因組DNA作為模板，進行LAMP擴增，檢驗LAMP方法的特異性。反應結(jié)束后肉眼觀察反應管內(nèi)顏色變化，并與LAMP濁度儀結(jié)果及凝膠電泳結(jié)果對比驗證。

1.8 LAMP方法靈敏度檢測 將針對EHEC O157∶H7的rfbE基因的PCR擴增產(chǎn)物(1094 bp)連接至PMD-18載體上(2692 bp)，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，篩選并提取重組質(zhì)粒，送金斯瑞公司測序。用紫外分光光度計測定其濃度和純度，計算質(zhì)粒拷貝數(shù)。計算公式：拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度(g/μl)×加樣體積×阿氏常數(shù)/(質(zhì)?？傞L度×1個bp的平均分子量)，根據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒稀釋成5×106拷貝/μL，然后進行10倍梯度稀釋，檢測107至100拷貝/反應管8個濃度梯度。

2 結(jié)果

2.1 HNB指示劑不同濃度顯色對比 120、150和200 μmol/L 3個HNB濃度進行顯色對比，結(jié)果見圖1。多次驗證發(fā)現(xiàn)，HNB的濃度為150 μmol/L時，陰性、陽性顏色對比差別最明顯，利于可視化判讀。

圖 1 120 μmol/L(左)、150 μmol/L(中)、200 μmol/L(右)的HNB顯色對比

2.2 LAMP反應體系溫度優(yōu)化 對同一反應體系設置不同溫度進行反應時，發(fā)現(xiàn)在63℃時，LAMP濁度儀最早出現(xiàn)波峰，并且擴增效率最高，因此選擇63℃為優(yōu)化溫度進行后續(xù)的靈敏度和特異性等實驗。

2.3 LAMP快速法與LAMP標準法比較 通過重復3次對比LAMP快速法(加環(huán)引物)與LAMP標準法發(fā)現(xiàn)，LAMP快速法實時濁度儀顯示在15 min開始有擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)，在40 min時接近擴增產(chǎn)物峰值；而LAMP標準法在30 min的時候出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，在60 min時接近產(chǎn)物峰值(圖2)。因此在后續(xù)實驗中，全部加環(huán)引物。

2.4 特異性檢測 僅EHEC O157∶H7反應管HNB顏色由紫羅蘭色變成天藍色，LAMP濁度儀檢測到陽性擴增結(jié)果，而 ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋內(nèi)志賀菌、福氏志賀菌反應管均未發(fā)生顏色變化，LAMP濁度儀也未出現(xiàn)擴增曲線，均為陰性。通過凝膠電泳驗證，僅EHEC O157∶H7出現(xiàn)LAMP特有的梯狀條帶，ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋內(nèi)志賀菌、福氏志賀菌均未出現(xiàn)。結(jié)果與HNB，LAMP濁度儀判讀結(jié)果一致。見圖3、4、5。

圖3 LAMP濁度儀特異性檢測結(jié)果

圖 3、4、5 中，1 為 EHEC O157∶H7；2 為 ETEC；3 為EPEC；4為ETEC；5為EAEC；6為宋內(nèi)志賀菌；7為福氏志賀菌；8為陰性對照。圖5中M為250 bp DNA marker。紅色：陽性；綠色：陰性；藍色：累計濁度

圖4 HNB特異性檢測結(jié)果

圖5 凝膠電泳特異性檢測驗證結(jié)果

2.5 靈敏度檢測 測序證實rfbE基因成功克隆到PMD-18載體上。經(jīng)紫外分光光度計測定顯示質(zhì)粒濃度為21.52 ng/μl。檢測結(jié)果顯示從107～102拷貝/反應管出現(xiàn)陽性擴增，10個拷貝/反應管以下為陰性。HNB、LAMP濁度儀及凝膠電泳結(jié)果一致，見圖 6、7、8。

圖6 LAMP濁度儀靈敏度檢測結(jié)果

圖6、7、8中，1～8分別為 O157∶H7 質(zhì)粒模板 107～100拷貝/反應管，圖8中M為250 bp DNA marker。本方法的檢測靈敏度是100拷貝/反應管。紅色：陽性；綠色：陰性；藍色：累計濁度

圖7 HNB指示劑靈敏度檢測結(jié)果

圖8 凝膠電泳靈敏度檢測結(jié)果

3 討論

傳統(tǒng)的EHEC O157∶H7的實驗室檢測方法耗時久，檢出率低，在食品衛(wèi)生檢測與疫情現(xiàn)場檢測領域缺少快速簡易的檢測方法。核酸檢測具有高靈敏度與特異性。LAMP技術原理與普通PCR技術不同，具有諸多優(yōu)點：一是同時針對目的片段8個不同區(qū)域，設計6條LAMP引物及2條環(huán)引物，因而具有特異性高的特點。二是由于其反應是等溫條件，不需要像普通PCR循環(huán)升溫降溫，因而對設備要求低，普通的恒溫水浴鍋即可。三是其反應形成啞鈴狀結(jié)構，核酸復制延伸的同時發(fā)生鏈置換反應，剝離先前合成的DNA鏈，產(chǎn)物是不同長度目的片段的重復序列，擴增效率高，1 h內(nèi)可將少量目的片段擴增至109［10］。四是在添加環(huán)引物情況下，增加了反應的起始點位，提高了反應的速率，在更短的時間內(nèi)就能出結(jié)果。五是其觀察結(jié)果方式多。

如果通過開蓋去檢測LAMP反應結(jié)果，容易造成氣溶膠污染，影響后續(xù)檢測。在不開蓋的前提下，其結(jié)果判定方式主要有目視檢查渾濁、目視檢查染料顏色變化和利用濁度儀對LAMP反應進行實時監(jiān)控這三種方法［11］。目視檢查渾濁法主要依據(jù)LAMP反應產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，但當產(chǎn)物較少時，肉眼很難察覺。實時濁度儀能夠更加直觀、精確地判定結(jié)果，但需要使用特定的儀器設備LAMP濁度儀，其價格昂貴，適合摸索反應條件、科學研究用，并不適合現(xiàn)場快速檢測。染料比色分析便捷、直觀，是最為簡單方便的LAMP結(jié)果判定方式，而使用HNB染料指示劑既不開蓋靈敏度又高。

本研究采用通過LAMP濁度儀優(yōu)化檢測條件，在反應前加入HNB染料通過顏色變化判斷結(jié)果，通過凝膠電泳驗證HNB顏色變化判讀結(jié)果的準確性。結(jié)果顯示，HNB指示劑陰、陽性結(jié)果顏色差別明顯，易于判斷，并且與LAMP濁度儀及凝膠電泳結(jié)果判讀一致，說明基于HNB染料的LAMP方法結(jié)果可信。在加了環(huán)引物LF、LB后，增加了DNA擴增的起點，擴增結(jié)果較不加環(huán)引物提前了20 min，在40 min內(nèi)即可出結(jié)果。本方法檢測的靈敏度達到100拷貝/反應管，靈敏度和實時熒光定量PCR相近，比普通PCR高100倍［12-13］。本法特異性強，僅EHEC O157∶H7 陽性，ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋內(nèi)志賀菌、福氏志賀菌均為陰性。本研究建立了EHEC O157∶H7環(huán)介導等溫擴增可視化檢測方法，整個反應在63℃恒溫條件下進行40 min便能直接判定結(jié)果，無需特殊儀器設備，簡便易行，可用于食品衛(wèi)生安全抽檢及疫情現(xiàn)場快速檢測。

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