郭婷婷，肖 雪，丁國(guó)鈺，彭佳敏，* ，高智慧，白 鋼

(1.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津市分子藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071;2.天津市啟仁醫(yī)藥科技有限公司，天津300457)

L-鳥氨酸是一種重要的非蛋白質(zhì)組成氨基酸，以游離的形式存在于組織和細(xì)胞中，具有重要的生理活性和功能［1］。L-鳥氨酸兼具有營(yíng)養(yǎng)和治療功能，在醫(yī)療保健［2-3］、化工［4］等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前L-鳥氨酸主要有化學(xué)合成法［5］、水解精氨酸法［6］、微生物發(fā)酵法［7］等，由于化學(xué)合成法得到的是消旋體，分離較難，故現(xiàn)階段的研究主要集中在水解精氨酸法和微生物發(fā)酵法，因此對(duì)酶促反應(yīng)液及發(fā)酵液中L-鳥氨酸的含量測(cè)定有著相當(dāng)重要的意義。建立一種簡(jiǎn)單、快速而又有效的檢測(cè)方法對(duì)于L-鳥氨酸的制備非常必要。目前，L-鳥氨酸的測(cè)定以采用HPLC 衍生化法［7］、氨基酸自動(dòng)分析儀法［8］、氣相色譜［9］、離子交換色譜［10］、酶法分析［11］和比色法［12］為多，而HPLC 衍生化法和氣相色譜法操作復(fù)雜，氨基酸自動(dòng)分析儀法費(fèi)用昂貴，比色法操作較為麻煩，耗時(shí)較長(zhǎng)。 近紅外光譜技術(shù) (Near Infrared Spectroscopy，NIRS)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種高新分析技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速、低成本、無(wú)污染、對(duì)樣品無(wú)破壞性以及可實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，是最適于實(shí)現(xiàn)在線分析和實(shí)時(shí)控制的成熟技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于釀酒［13］、制藥［14］、化工［15］、食品［16］等行業(yè)的質(zhì)量監(jiān)測(cè)、控制和相關(guān)研究。NIRS 在發(fā)酵過(guò)程檢測(cè)領(lǐng)域的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道，早在1990 年，Cavinato 等人［17］采用光電二極管陣列光譜結(jié)合光纖探頭產(chǎn)生短波NIR 光譜監(jiān)測(cè)玻璃壁的發(fā)酵罐中乙醇含量;劉國(guó)海等［18］利用NIRS 結(jié)合ELM 快速檢測(cè)秸稈蛋白飼料固態(tài)發(fā)酵過(guò)程參數(shù)值pH。在氨基酸生產(chǎn)方面，Arnold 等人［19］成功的將NIR 技術(shù)應(yīng)用于CHO 細(xì)胞分批發(fā)酵過(guò)程中谷氨酰胺、氨基酸、乳酸和葡萄糖的含量測(cè)定，但其他相關(guān)報(bào)道較少。本文通過(guò)NIRS 分析法能夠快速測(cè)定絕大多數(shù)種類的化合物及其混合物，對(duì)酶法制備過(guò)程進(jìn)行迅速監(jiān)測(cè)，從而準(zhǔn)確快速確定L-鳥氨酸酶法制備的終點(diǎn)。利用NIRS 對(duì)酶促反應(yīng)主產(chǎn)物L(fēng)-鳥氨酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合偏最小二乘法對(duì)其建立了定量模型，并進(jìn)行了初步的含量預(yù)測(cè)，為L(zhǎng)-鳥氨酸酶法制備的在線控制提供了一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

精氨酸酶 天津啟仁醫(yī)藥科技有限公司(批號(hào)為20110919);L-精氨酸(純度＞99.0%) 阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司;茚三酮、冰乙酸、磷酸等 分析純，天津光復(fù)化學(xué)試劑研究所。

UV-1800 型紫外分光光度計(jì) 日本SHIMADZU公司;KQ3200 型超聲波清洗儀 昆山超聲儀器有限公司;HB-202 型恒溫金屬浴 上海民儀電子有限公司;Tensor 37 型近紅外光譜儀 德國(guó)Bruker 公司;Milli-Q 純化水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L-鳥氨酸含量測(cè)定 L-鳥氨酸酶活測(cè)定及含量測(cè)定均采用茚三酮比色法［12］。

1.2.2 L-鳥氨酸酶法制備 利用精氨酸酶將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-鳥氨酸，響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定酶促反應(yīng)的最佳條件為:L-精氨酸150g/L，精氨酸酶0.5g/L，pH10，反應(yīng)溫度37℃。在最佳條件下進(jìn)行反應(yīng)，收集0～12h 反應(yīng)樣品;將反應(yīng)體系擴(kuò)大10 倍，在最佳條件下進(jìn)行反應(yīng)并收集樣品。

1.2.3 近紅外光譜掃描 采集不同時(shí)間樣品的透射光譜圖，光譜掃描范圍4000～12000cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率為8cm-1，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3 次，液體樣品池為2mm 光程的石英比色皿，實(shí)驗(yàn)采用空氣為參比進(jìn)行光譜掃描，測(cè)量時(shí)溫度為25℃，濕度為50%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用了多種預(yù)處理方法如無(wú)光譜預(yù)處理(No spectral data preprocessing)、一階導(dǎo)數(shù)(Frist Derivation)、二階導(dǎo)數(shù)(Second Derivation)、矢量歸一化(Vector normalization，SNV)、多元散射校正(Multiplicative scattering correction，MSC )、Frist Derivation + SNV 和Frist Derivation + MSC 等對(duì)光譜進(jìn)行處理，并建立模型。建模樣品按照校正集∶預(yù)測(cè)集=4∶1 的比例劃分校正集與預(yù)測(cè)集，其中校正集的濃度范圍大于預(yù)測(cè)集。

采集的光譜數(shù)據(jù)，均運(yùn)用OPUS 7.0 數(shù)據(jù)分析軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-鳥氨酸樣品的制備

2.1.1 精氨酸酶活力測(cè)定 通過(guò)酶活力測(cè)定最終得到L-鳥氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A =3.305c-0.0274，R2=0.9978，其中A 為吸光度，c 為L(zhǎng)-鳥氨酸的濃度。精氨酸酶活力為6317U/g。

2.1.2 L-鳥氨酸樣品的制備 收集不同時(shí)間反應(yīng)樣品，采用茚三酮比色法測(cè)定L-鳥氨酸，并計(jì)算酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化趨勢(shì)圖Fig.1 The curve of enzymatic reaction conversion versus time

2.2 模型的建立與選擇

2.2.1 近紅外光譜采集及波長(zhǎng)區(qū)間選擇 采集樣品的透射光譜，原始光譜見(jiàn)圖2。共收集97 份樣品，其中77 份用于建模，20 份用于外部檢驗(yàn)。由圖2 可見(jiàn)，在5500～4000cm-1，儀器噪音較大，不適合建立模型，故選擇10000.0～5500.0cm-1波段建立模型。

圖2 樣本原始光譜圖Fig.2 The original near infrared transmitted spectra of the samples

2.2.2 預(yù)處理方法選擇 表1 為分別采用無(wú)光譜預(yù)處理、一階導(dǎo)數(shù)光譜、二階導(dǎo)數(shù)光譜、矢量歸一化光譜、多元散射校正、一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化和一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正等方法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理后所建立模型的預(yù)測(cè)均方差(RMSEP)、校正均方差(RMSEE)和決定系數(shù)(R2)。由表1 可知，采用一階導(dǎo)數(shù)對(duì)光譜預(yù)處理時(shí)RMSEP 最小，R2值最大，RMSEE 較小，R2較大，效果最好。不同預(yù)處理方法得到的光譜圖如圖3 所示。

2.2.3 主因子數(shù)選擇 用偏最小二乘法建立校正模型，主成分?jǐn)?shù)的選擇對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力影響較大。主成分?jǐn)?shù)太多，使模型包含過(guò)多的測(cè)量噪音;主成分?jǐn)?shù)過(guò)少，導(dǎo)致建模信息不全，預(yù)測(cè)能力差［20］。本研究采用檢驗(yàn)集檢驗(yàn)法，根據(jù)RMSEP 與RMSEE 隨主因子數(shù)變化圖(圖4)，選擇主因子數(shù)為4。

2.2.4 模型建立 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在10000.0 ～5500.0cm-1波段范圍內(nèi)建立數(shù)學(xué)模型，最終選擇一階

圖3 不同預(yù)處理優(yōu)化后圖譜Fig.3 The spectra after the optimization of the different pretreatment

圖4 檢驗(yàn)集檢驗(yàn)均方差與主因子數(shù)相關(guān)圖Fig.4 Relationship of the rank and the RMSEP ＆ RMSEE of the test set validation

圖5 校正集樣品(A)與檢驗(yàn)集樣品(B)的預(yù)測(cè)值與測(cè)定值的相關(guān)圖Fig.5 Correlation of NIR predicted and measured values for calibration set(A)and validation set(B)

2.3 模型的驗(yàn)證及應(yīng)用

2.3.1 模型外部驗(yàn)證 利用建立的定量模型，預(yù)測(cè)驗(yàn)證集的20 個(gè)樣品，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖可見(jiàn)，20 個(gè)樣品近紅外光譜預(yù)測(cè)值與測(cè)定值的相關(guān)性良好，外部驗(yàn)證模型相關(guān)系數(shù)R2為0.9827，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)效果較好。

2.3.2 模型的應(yīng)用 將建立的模型用于放大反應(yīng)體系后樣品的測(cè)定。由于反應(yīng)體系發(fā)生變化，需要對(duì)模型進(jìn)行校正。校正后模型參數(shù)如表3 所示。校正后模型與原模型相比較，模型的相關(guān)系數(shù)與均方差均略微降低，但仍可滿足測(cè)定要求。利用校正后的模型，預(yù)測(cè)放大反應(yīng)體系后的28 個(gè)樣品，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖可見(jiàn)，28 個(gè)樣品近紅外光譜預(yù)測(cè)值與測(cè)定值的相關(guān)性良好，模型預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)R2為0.9874，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)效果較好。

3 結(jié)論

L-鳥氨酸是一種多功能的氨基酸，應(yīng)用越來(lái)越廣泛，有很強(qiáng)的開發(fā)價(jià)值，同時(shí)具有巨大的市場(chǎng)空間。與常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法相比，NIRS 樣品無(wú)需前處理，準(zhǔn)確性較高、費(fèi)用低、耗時(shí)短、適用于生產(chǎn)過(guò)程在線監(jiān)測(cè)分析。本文利用NIRS 建立了L-鳥氨酸含量定量模型并驗(yàn)證了模型能力，并將NIRS 應(yīng)用于模擬監(jiān)測(cè)L-鳥氨酸酶法制備過(guò)程中含量動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果證明:模型預(yù)測(cè)效果較好，可以用于L-鳥氨酸酶法制備實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，同時(shí)也為L(zhǎng)-鳥氨酸及其他氨基酸生產(chǎn)過(guò)程中的檢測(cè)提供一種新的研究思路。

表1 光譜預(yù)處理方法對(duì)分析模型的影響Table 1 Effect of different pretreatments on analysis model

表2 模型參數(shù)Table 2 Parameters of the model

表3 校正后模型參數(shù)Table 3 Parameters of the model after calibration

圖6 模型預(yù)測(cè)集相關(guān)圖Fig.6 Correlation of prediction values and measured values on the model

圖7 校正后模型驗(yàn)證相關(guān)圖Fig.7 Correlation of prediction values and measured values on the model after calibration

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