趙 玲，王程程，李敏通，王蓉暉，李延斌，胡耀華，*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院，陜西楊凌712100;2.美國阿肯色大學(xué)生物和農(nóng)業(yè)工程系，阿肯色州費(fèi)耶特維爾72701)

志賀氏菌屬是革蘭氏陰性、兼性厭氧、無芽孢、不運(yùn)動(dòng)、通常不發(fā)酵乳糖的棒狀桿菌。志賀氏菌屬是引起人類腸道疾病常見的病原菌，在我國感染性腹瀉病原菌中高居首位［1］。目前在國內(nèi)外，直接從食品中制備的樣品往往因?yàn)楹械哪繕?biāo)微生物太少難以檢測，所以大多都采用先增菌后檢測的方式，這時(shí)不僅會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間，而且檢測可信性差［2］。利用人工合成的磁性顆粒對目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行分離、濃縮進(jìn)而檢測的方法在以往已經(jīng)有了快速的發(fā)展［3］。細(xì)胞的磁性分離與其他的分離方法相比可以使細(xì)胞直接從原始的食品樣品里分離并且簡單、快速，與電磁場相比，靜磁場也不會(huì)干擾水溶液中離子和帶電溶質(zhì)的移動(dòng)。目前已有利用免疫納米磁珠實(shí)現(xiàn)對食源性病原菌如大腸桿菌［4］、沙門氏菌［5］、李斯特菌［6］、阪崎桿菌［7］等腸道致病菌的特異、快速的富集，并結(jié)合量子點(diǎn)熒光標(biāo)記、吸光度檢測、ELISA 等方法或是各種PCR 方法實(shí)現(xiàn)對單個(gè)或多種目標(biāo)菌的定量檢測［8-14］。目前還沒有采用該種方法對志賀氏菌進(jìn)行分離、富集的報(bào)道，本研究制備免疫納米磁珠(immunomagnetic nanobeads，Immuno-MNBs)，將針對目標(biāo)抗原的特異性抗體直接包被于磁珠的表面，從而能夠識別目標(biāo)微生物，利用其超順磁性和特異性，對食品中的福氏志賀氏菌在磁場中進(jìn)行特異性捕獲，實(shí)現(xiàn)對食品中福氏志賀氏菌的快速、高效、特異性分離和富集。為更簡便、快捷的定量檢測志賀氏菌做好前期準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草原興發(fā)冷凍羊肉卷 購于當(dāng)?shù)爻?福氏志賀氏菌(ATCC12022) 購自美國菌種保藏所;生物素化的志賀氏菌多克隆抗體(4 ～5mg/mL) 購于Pierce Biotechnology 公司;鏈酶親和素納米磁珠(以CdSe/CdTe 為核的核殼結(jié)構(gòu)，粒徑(180 ±20)nm)購于江陰美英特生物儀器科技有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1mol/L，pH7.4) 購于Sigma 公司;LB肉湯、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、Baird-Parker 培養(yǎng)基基礎(chǔ)等 均購于北京陸橋公司;實(shí)驗(yàn)中所用耗材均為無菌。

MS0206 磁分離器(0.4T) 江陰美英特生物儀器科技有限公司;YT-CJ-1N 型超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心;PB-10pH 計(jì) 德國Sartorius 公司;智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫納米磁珠的制備 取生物素化的志賀氏菌多克隆抗體和鏈酶親和素化的磁珠，分別用適量PBS 稀釋混勻后按照GB4789.5-2012 的方法，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上鋪盤，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)20～24h，觀察有無雜菌。若有雜菌，用1% NaN3處理24h，用PBS 充分洗滌后再鋪盤觀察，若無雜菌則可直接用于以下實(shí)驗(yàn)。

取1mL 鏈酶親和素納米磁珠((180 ±20)nm，2mg/mL)3 份，在磁分離器上分別用500μL 的PBS進(jìn)行洗滌，各2 次。分別用450、430、410μL 的PBS重新懸掛，依次移取50、70、90μL 的生物素化的志賀氏菌抗體(4～5mg/mL)加入到已洗好的磁珠溶液中，使總體積均達(dá)到500μL，渦旋混合均勻后，在試管混合器上混合，室溫反應(yīng)30min［15-16］。反應(yīng)完全后利用PBS 洗滌，在磁分離器(0.4T)上分離1.5min 后去掉上清液，重復(fù)清洗2 次，加1%牛血清蛋白(純度＞98%，WOLSEN 公司)的PBS 混合60min，對磁珠上鏈酶親和素的多余位點(diǎn)進(jìn)行封閉。封閉完成后用PBS 徹底清洗2 次，再用1mL 的PBS 重懸，得到的免疫納米磁珠復(fù)合物分別標(biāo)記為:Immuno-MNBs50，Immuno-MNBs70，Immuno-MNBs90。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)與計(jì)數(shù) 蘸取少量福氏志賀氏菌的凍干粉加入到營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行活化(37℃，20h)，再在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上分離出純的單菌落，在營養(yǎng)瓊脂上再次擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌種保存于甘油和營養(yǎng)肉湯按1∶1 比例配制的保存液里。

取上面保存液里的純的福氏志賀氏菌種1～9mL的LB 營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)10h 時(shí)移取1mL 于事先滅菌好的PBS 里進(jìn)行一系列稀釋，依次編號為1、2、3、4、5、6、7、8 以及一個(gè)空白。由平板計(jì)數(shù)的方法得知各梯度目標(biāo)細(xì)菌數(shù)。

1.2.3 對純菌液里目標(biāo)細(xì)菌的捕獲 分別取出Immuno - MNBs50，Immuno - MNBs70，Immuno -MNBs90 三種免疫磁珠各20、40、60μL 與104CFU/mL接種量的目標(biāo)菌100μL，用PBS 溶液定容到1mL 后在試管搖床上以15r/min 的轉(zhuǎn)速在室溫下反應(yīng)45min［15-16］。反應(yīng)完成后用PBS 洗滌至少2 次，廢液收集并保存，用1mL 的PBS 重懸反應(yīng)復(fù)合物，以得到103CFU/mL 細(xì)菌數(shù)量時(shí)各種免疫磁珠的捕獲效率。分別對純菌液、免疫磁珠捕獲的菌液、以及廢液進(jìn)行鋪盤(作對照)，各做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

再取Immuno-MNBs70 各40μL 和60μL 分別與接種量為103、104、105CFU/mL 的純菌液100μL 在室溫下混合反應(yīng)45min。反應(yīng)完成后洗滌，去掉多余的清液(廢液需收集)，用1mL 的PBS 重懸反應(yīng)復(fù)合物，需要稀釋才能讀數(shù)的組系按細(xì)菌數(shù)量適量稀釋。分別對各梯度目標(biāo)細(xì)菌的純菌液、免疫磁珠捕獲的菌液、廢液進(jìn)行鋪盤，各做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。將分別得到40μL 和60μL 的Immuno-MNBs70 對102、103、104CFU/mL 細(xì)菌數(shù)量目標(biāo)細(xì)菌的捕獲效率。

理論上，捕獲效率(capture efficiency，CE)CE(%)=Nc/N0×100，其中，Nc是捕獲得到的細(xì)菌數(shù)，單位為CFU/mL;N0是原始的細(xì)菌數(shù)量，單位為CFU/mL。

1.2.4對低濃度目標(biāo)菌的捕獲 取100、101、102CFU/mL 接種量的純菌液1mL 在室溫下分別與Immuno-MNBs70 的免疫磁珠60μL 混合反應(yīng)45min。反應(yīng)完成后洗滌，廢液收集，用1mL 的PBS 重懸反應(yīng)復(fù)合物。分別對原始純菌液、免疫磁珠捕獲的菌液、廢液進(jìn)行鋪盤，各三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 對食品中目標(biāo)菌的捕獲 稱取25g 羊肉樣品于225mL 已滅菌的0.1%的PBS 緩沖液中，混合1min后，移取4 份樣液，其中一份為10mL 不接種做為空白實(shí)驗(yàn)。其余三份為9mL，接種福氏志賀氏菌(ATCC12022)，使樣品里最終細(xì)菌數(shù)量達(dá)到101～103CFU/mL。樣品前處理好后，添加免疫磁珠Immuno-MNBs70 各60μL 分別對空白實(shí)驗(yàn)、101、102、103CFU/mL 濃度的目標(biāo)菌進(jìn)行捕獲，捕獲后洗滌，廢液保留，對純菌液、捕獲得到的菌液、廢液均鋪盤計(jì)數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 本實(shí)驗(yàn)所有的微生物檢測都重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性。所有目標(biāo)細(xì)菌捕獲效率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差值都通過Microsoft Excel(Microsoft Corporation)計(jì)算得到。

2 結(jié)果與分析

2.1 多克隆抗體包被鏈酶親和素納米磁珠加入量的優(yōu)化選取

分別用Immuno - MNBs50，Immuno - MNBs70，Immuno-MNBs90 三種免疫磁珠各20、40、60μL 三種不同加入量捕獲103CFU/mL 細(xì)菌數(shù)量的福氏志賀氏菌。由圖1 可以看到，免疫納米磁珠Immuno-MNBs70 對目標(biāo)細(xì)菌的捕獲效率最高，它在40μL 和60μL 加入量時(shí)分別可達(dá)到58.6%和61.2%，所以可以選取70μL 的生物素化抗體為制備免疫納米磁珠時(shí)的較優(yōu)加入量。Immuno-MNBs50 在60μL 的加入量時(shí)也達(dá)到了59.4%，說明60μL 加入量的捕獲效率最好。而抗體加入量為90μL 的免疫納米磁珠Immuno-MNBs90 對目標(biāo)菌的捕獲效率在8.9% ～25%之間，如圖1 所示?？赡墚?dāng)加入的抗體過多時(shí)，吸附到細(xì)菌上的免疫磁珠增多，在強(qiáng)磁場下分離的時(shí)候會(huì)造成部分細(xì)菌的損傷，由此可知，納米磁珠對目標(biāo)細(xì)菌的捕獲效率并不隨著抗體加入量的增多而增高，而是可以得到一個(gè)優(yōu)化值。

圖1 三種抗體濃度的Immune-MNBs對103CFU/mL 目標(biāo)細(xì)菌捕獲效率的比較Fig.1 The capture efficiency of the three different antibody concentrations of Immune-MNBs for 103CFU/mL target bacteria

2.2 免疫磁珠捕獲目標(biāo)細(xì)菌時(shí)其加入量的選取

用免疫磁珠Immuno-MNBs70 的40μL 和60μL的加入量分別捕獲102、103、104CFU/mL 細(xì)菌數(shù)量的福氏志賀氏菌。發(fā)現(xiàn)對于細(xì)胞數(shù)量為102、103、104CFU/mL 的細(xì)菌，40μL 和60μL 的加入量對其捕獲效率都非常的接近，通過t 檢驗(yàn)，|t| =7.0 ＜t(2)0.01=9.925，則p ＞0.01，說明對于102、103、104CFU/mL 的細(xì)菌數(shù)量，40μL 和60μL 的加入量對捕獲效率的差異顯著性不大，捕獲效率在60μL 時(shí)比40μL 時(shí)略高，如圖2 所示，選取免疫磁珠較優(yōu)加入量為60μL。

圖2 Immuno-MNBs70 不同加入量對102、103、104CFU/mL 目標(biāo)菌的捕獲效率比較Fig.2 The capture efficiency comparison of the different addition amount of the Immuno-MNBs70 for 102，103，104CFU/mL target bacteria

2.3 對低濃度目標(biāo)細(xì)菌的捕獲

用免疫納米磁珠Immuno-MNBs70 的60μL 加入量捕獲101、102CFU/mL 細(xì)菌數(shù)量的目標(biāo)菌，得到的捕獲效率分別是:83.8% ±2.2%、65% ±3.0%?？梢钥闯鲚^高濃度的目標(biāo)細(xì)菌，免疫納米磁珠對低濃度目標(biāo)細(xì)菌捕獲效率有所增大。對于100CFU/mL 數(shù)量的目標(biāo)菌，即個(gè)位數(shù)量的菌液，菌落計(jì)數(shù)如表1。可見，該種捕獲方法的捕獲限可以達(dá)到100CFU/mL。

表1 該免疫磁珠對100CFU/mL 目標(biāo)菌的捕獲結(jié)果Table 1 The capture efficiency of the Immuno-MNBs to 100CFU/mL number of target bacteria

2.4 對食品樣品中福氏志賀氏菌的檢測

在未接種福氏志賀氏菌的空白實(shí)驗(yàn)中，樣液、捕獲液和廢液里均有極少量的非福氏志賀氏菌的雜菌出現(xiàn)。除去極少量非福氏志賀氏菌雜菌外，對于102和103CFU/mL 接種量的食品樣品，得到的捕獲效率分別為73.3% ±4.6%和67.1% ±2.5%，對101CFU/mL 樣品液，其樣液與捕獲液的菌落數(shù)相近，而且廢液里也無目標(biāo)菌出現(xiàn)。說明對于羊肉樣品，其捕獲限可達(dá)到101CFU/mL，這對食品中低濃度目標(biāo)菌的快速檢測有良好的效果。

與已有的以SPA 包被的磁珠制備的多抗免疫磁珠對福氏志賀氏菌純菌液(102CFU/mL)的富集作用(捕獲效率約為46.9%)相比［17］，該方法可以達(dá)到較高的捕獲效率(65%)，并且與GB4789.5-2012 的分離方法相比較，該方法不需要對食品樣品進(jìn)行16～20h 的增菌處理，可以節(jié)省時(shí)間。

3 結(jié)論

3.1 志賀氏菌多克隆抗體(4～5mg/mL)包被1mL 鏈酶親和素納米磁珠((180 ±20)nm，2mg/mL)的最佳加入量應(yīng)該選取為70μL，在捕獲高濃度目標(biāo)細(xì)菌時(shí)，該制備好的免疫納米磁珠的最佳加入量應(yīng)為60μL，此時(shí)捕獲效率最高，對于103CFU/mL 細(xì)菌量目標(biāo)細(xì)菌的捕獲效率可達(dá)到61.2%。

3.2 對于低濃度純菌液目標(biāo)菌的捕獲，其捕獲效率比較高濃度菌液有所提高，捕獲限可以達(dá)到100CFU/mL，對于羊肉卷樣品，免疫磁珠對目標(biāo)菌的捕獲限可以達(dá)到101CFU/mL，并且捕獲時(shí)間小于1h。

3.3 利用免疫納米磁珠能夠快速、有效地對食品樣品中目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行富集、分離，對以后能夠快速、準(zhǔn)確的定量檢測食品中的目標(biāo)細(xì)菌提供了理論依據(jù)，并且該實(shí)驗(yàn)可以得到3～4CFU/mL 目標(biāo)細(xì)菌數(shù)量的捕獲限，這對食品安全檢測意義重大。

［1］林曉麗，賴衛(wèi)華，張莉莉.志賀氏菌檢測方法的最新研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2009，30(15):271-275.

［2］翁仕強(qiáng)，潘迎捷，趙勇，等.納米技術(shù)在食品安全快速檢測中的應(yīng)用［J］.漁業(yè)現(xiàn)代化，2009，36(3):56-59.

［3］崔海燕，胡巍.磁性納米磁珠在微生物學(xué)檢測中的應(yīng)用［J］.微生物免疫學(xué)進(jìn)展，2011，39(2):57-59.

［4］YANG L J，LI Y B.Simultaneous detection of Escherichia coli O157∶H7 and Salmonella Typhimurium using quantum dots as fluorescence labels［J］.Analyst，2006，131:394-401.

［5］LI Y，LI Y B. Quantum dots as fluorescent labels for quantitative detection of Salmonella Typhimurium in chicken carcass wash water［J］.Food Protection，2005，68:1241-1245.

［6］WANG H，LI Y B，SLAVIK M F.Rapid detection of Listeria monocytogenes using quantum dots and nanobeads-based optical biosensor［J］. Journal of Rapid Methods ＆ Automationin Microbiology，2007，15:67-76.

［7］支援，孟瑾，鄭小平，等.一種快速檢測阪崎腸桿菌的新方法-免疫磁性分離熒光標(biāo)記［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2010，5:231-234.

［8］LIU Y C，LI Y B.Detection of Escherichia coli O157∶H7 using immunomagnetic separation and absorbance measurement［J］.Journal of Microbiological Methods，2002，51:369-377.

［9］鐘青萍，葛萃萃，張世偉.檢測食品中志賀氏菌的雙抗夾心ELLISA 方法的研究［J］.食品科技分析檢測，2007，32(10):199-202.

［10］胡建華，李潔莉，馬兆飛.牛奶樣品中志賀氏菌的快速PCR 檢測技術(shù)研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(8):433-437.

［11］盧富山，王云龍，景建州.應(yīng)用DPO 技術(shù)檢測食源性致病菌的多重PCR 的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(2):199-202.

［12］BARLETTA F，LIU Q A，CLEARY T，et al.Detection of Campylobacter spp.，Salmonella spp.，and Shigella spp.enteropathogens by real - time multiplex PCR［J］. Tropical Medicine ＆ International Health，2011，16:255-256.

［13］MOKHTARI W，NSAIBIA S，MAJOURI D，et al.Detection and characterization of Shigella species isolated from food and human stool samples in Nabeul，Tunisia，by molecular methods and culture techniques［J］. Journal of Applied Microbiology，2012，113:209-222.

［14］李雅靜，吳紹強(qiáng).免疫磁性分離技術(shù)在食源性疾病檢測中的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2008，29(12):248-251.

［15］WANG H，LI Y B，WANG A，et al.Rapid，sensitive，and simultaneous detection of three foodborne pathogen using magnetic nanobead- based immunoseparation and quantum dot - based multiplex immunoassay［J］.Journal of Food Protection，2011，74(12):2039-2047.

［16］WANG H，LI Y B，Slavik M F.Rapid detection of listeria monocytogenes in different food sample using magnetic nanobeads and a quantum dots based fluorescent immunosensor method［J］.Biological Engineering，2011，4(4):183-194.

［17］肖敏，易勇，毛旭虎，等.免疫分離及免疫比濁分析對福氏志賀氏菌的自動(dòng)快速定量檢測［J］.免疫學(xué)雜志，2009，25(3):341-345.