宋廣斌　張藝瑩　張巖　王心彧

【摘要】目的探討Survivin基因在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及其意義。方法選取我院2009年1月——2012年12月30例中耳膽脂瘤患者，設(shè)定為研究組，并選取30例健康者作為對照組，以免疫組織化學(xué)（Envision System）染色技術(shù)和RT-PCR法，分析對比Survivin基因在兩組患者中的表達(dá)。結(jié)果研究組患者中20例（66.67%）Survivin基因蛋白染色呈現(xiàn)陽性，對照組未呈現(xiàn)陽性表達(dá)，只有極少數(shù)分散狀陽性細(xì)胞，兩組存在較明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。研究組中SurvivinmRNA有一定表達(dá)，對照組未出現(xiàn)表達(dá)。結(jié)論中耳膽脂瘤患者組織能夠顯著呈現(xiàn)Survivin表達(dá)，健康者不會有表達(dá)現(xiàn)象。

【關(guān)鍵詞】中耳膽脂瘤；Survivin基因；免疫組織化學(xué)

本文選取了30例中耳膽脂瘤患者，探討Survivin基因表達(dá)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取我院2009年1月——2012年12月30例中耳膽脂瘤患者，設(shè)定為研究組，其中男16例，女14例，并選取30例健康者作為對照組，其中男15例，女15例；年齡21-68，平均（35.8±3.5）歲。研究組病程2-10年，平均（5.6±1.6）年。選取已知陽性切片為陽性對照，PBS液作為陰性對照。

1.2方法兩組均應(yīng)用免疫組化方法進(jìn)行測定。采選組織以4%甲醛固定液保持24h固定，常規(guī)法應(yīng)用石蠟進(jìn)行包埋，并切片，烘干。然后以常規(guī)法脫蠟。予以抗原修復(fù)后，滴入一抗，4℃環(huán)境下孵育過夜，后滴入二抗。以DAB顯色試劑顯色，在光鏡下保持顯色時(shí)間。選取蘇木素進(jìn)行復(fù)染，后以中性樹膠實(shí)施封片，應(yīng)用光鏡予以觀察。

半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測方法[1]：所選取組織標(biāo)本從液氮取出然后研磨為粉狀，加進(jìn)適宜RNAiso Reagent對總RNA進(jìn)行提取，以核酸/蛋白分析儀對mRNA進(jìn)行測定，RNA OD值保持在1.6-1.8。RT-PCR：將存品總RNA（5-10ug），加入到標(biāo)準(zhǔn)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系當(dāng)中，46℃狀態(tài)下保持60min，99℃狀態(tài)下保持5min，5℃狀態(tài)下保持5min。擴(kuò)增PCR，以4.0ul cDNA作為模板，50ul標(biāo)準(zhǔn)化PCR反應(yīng)體系，94℃4min變性；94℃30sec，59.3℃50sec，72℃50sec，實(shí)施30個(gè)循環(huán)態(tài)；于72℃10min進(jìn)行延伸。內(nèi)參照選取β-actin，退火溫度設(shè)定59.8℃，然后將其擴(kuò)增30循環(huán)。將5ulPCR產(chǎn)物放置在1.0%瓊脂糖凝膠上保持電泳30min，應(yīng)用溴乙錠進(jìn)行染色。

表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)[2]：Survivin蛋白免疫組化經(jīng)染色細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色表示其為陽性，每個(gè)標(biāo)本均需隨機(jī)選取3張切片統(tǒng)計(jì)其細(xì)胞數(shù)量。應(yīng)用光鏡200倍對陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每片選擇3個(gè)不相同視野，確保視野清晰，每個(gè)視野下觀察到的陽性細(xì)胞（%）=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。觀察對比兩組Survivin基因表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析陽性細(xì)胞總計(jì)以 表示，以t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

3討論

中耳膽脂瘤屬于耳科中常見疾病，會引發(fā)較為嚴(yán)重的顱內(nèi)外并發(fā)癥，對患者生命健康造成較為嚴(yán)重的影響。臨床醫(yī)學(xué)中還沒有較為明確的闡明中耳膽脂瘤疾病發(fā)病機(jī)制，因此并不存在效果極佳的藥物治療措施，必須予以手術(shù)治療。有資料顯示，膽脂瘤上皮細(xì)胞因?yàn)榈蛲龆艿揭种剖侵卸懼黾膊“l(fā)生、發(fā)展的重要原因。本文應(yīng)用免疫組化法對Survivin進(jìn)行，結(jié)果較為顯著。Survivin基因?qū)儆谳^為新型的凋亡抑制蛋白（IAP），屬于目前能夠克隆的最小IAP。Survivin在組織當(dāng)中的分布有較為顯著的細(xì)胞選擇性，胚胎組織當(dāng)中具有較多的表達(dá)，但是終末分化成熟組織通常無法檢測到其表達(dá)，大部分腫瘤組織中或是轉(zhuǎn)化細(xì)胞均能夠檢測到其高表達(dá)現(xiàn)象[3]。

通過本文研究可以知道，膽脂瘤上皮Survivin表達(dá)比對照組健康外耳道者的皮膚上皮呀顯著高出很多。Park等人有資料顯示，Survivin在獲得性膽脂瘤上皮中存在的表達(dá)要顯著高于先天膽脂瘤。

總之，Survivin基因能夠參與到中耳膽脂瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展中，和膽脂瘤上皮細(xì)胞大量繁殖存在一定相關(guān)性，給基因治療方法的研究應(yīng)用提供了較有效的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]伍千元，李建軍，李龍平.Survivin及Livin在中耳膽脂瘤組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].中國實(shí)用醫(yī)學(xué)，2011，6（1）：3-4.

[2]楊寧，蔣立新.凋亡抑制蛋白Livin及Survivin在中耳膽脂瘤上皮的表達(dá)及意義[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2011，19（4）：356-358.

[3]殷團(tuán)芳，任基浩.中耳膽脂瘤的發(fā)生及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報(bào)，2010，24（1）：29-33.