肖驍 字向東等

摘要：為了探討藏山羊低氧生態(tài)適應(yīng)性的分子調(diào)節(jié)機(jī)理，采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對藏山羊和樂至黑山羊低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF165）及其受體FLT-1和FLK-1基因的表達(dá)量進(jìn)行測定。結(jié)果表明，在垂體組織中，樂至黑山羊hif-1α、vegf165和flk-1的mRNA相對表達(dá)量分別是藏山羊的1.43倍、1.93倍和4.25倍，差異顯著（P<0.05），flt-1的mRNA相對表達(dá)量是藏山羊的1.22倍，無顯著差異（P>0.05）；在肝臟組織中，樂至黑山羊hif-1α、vegf165和flt-1的mRNA相對表達(dá)量分別是藏山羊的2.08倍、1.52倍和3.21倍，差異顯著（P<0.05），flk-1的mRNA相對表達(dá)量是藏山羊的1.17倍，無顯著差異（P>0.05）。說明經(jīng)過長期生物進(jìn)化和環(huán)境選擇，藏山羊?qū)τ诟咴脱醐h(huán)境已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的適應(yīng)性，目的基因的表達(dá)量均低于樂至黑山羊。

關(guān)鍵詞：藏山羊；實(shí)時熒光定量PCR；mRNA表達(dá)量；低氧適應(yīng)性

中圖分類號：S827 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2181-04

低氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia inducible factor-1， HIF-1）是一種能特異性結(jié)合于促紅細(xì)胞生成素基因的低氧反應(yīng)原件（HRE）的DNA結(jié)合蛋白，它廣泛參與動物細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，是細(xì)胞適應(yīng)低氧的重要蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[1]。HIF-1是由對氧敏感的α亞基和穩(wěn)定表達(dá)的β亞基組成的異源二聚體[2]。作為HIF-1的調(diào)節(jié)亞基和活性亞基，HIF-1α決定HIF-1的活性，實(shí)現(xiàn)HIF-1的生物效應(yīng)。低氧環(huán)境下HIF-1α在組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在某些基因的啟動子、增強(qiáng)子或其他調(diào)控區(qū)也都含有HIF-1α的特異結(jié)合序列，這說明在低氧誘導(dǎo)的各種相關(guān)基因的表達(dá)中HIF-1α起著關(guān)鍵作用[2]。

血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是對血管形成具有重要作用的生長因子。它是內(nèi)皮細(xì)胞特異的絲裂素（Mitogen），能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的活性。根據(jù)VEGF含有氨基酸數(shù)量的不同，可以分為VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206

6種亞型[3，4]。其中VEGF165的生物活性最強(qiáng)、含量最多。VEGF有已知的3種受體：VEGFR-1（Fms-like tyrosine kinase，F(xiàn)LT-1），VEGFR-2（Kinase domain region，also referred to as fetal liver kinase，KDR/FLK-1），VEGFR-3（The fms-like tyrosine kinase，F(xiàn)LT-4）[5]。它們均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)組成。其中VEGFR-1與VEGF的親和力最強(qiáng)，是VEGFR-2的10倍[6，7]。

藏山羊是我國青藏高原的特有畜種，是一個古老的地方山羊品種，迄今為止已有4 000多年的歷史。它主要分布在西藏、四川、青海和甘肅等海拔1 500～5 000 m的高寒牧區(qū)，具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，能適應(yīng)高原地區(qū)各種嚴(yán)酷的自然生態(tài)條件，是藏族同胞重要的生產(chǎn)資料和生活資料[8]。樂至黑山羊是四川省樂至縣經(jīng)過長期選育而成的優(yōu)秀地方品種，主要分布在海拔300～600 m的平原地區(qū)。近年來對與環(huán)境作用相關(guān)的功能基因已有越來越深入的了解，關(guān)于高原物種環(huán)境適應(yīng)性的研究也有一些報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)將對高原低氧、低溫環(huán)境有著極強(qiáng)適應(yīng)能力的高原土著品種藏雞與白來航雞和壽光雞兩個低地品種進(jìn)行全期模擬低氧孵化，藏雞的孵化率顯著高于兩個低地雞品種，表現(xiàn)出了高度的耐受低氧環(huán)境的能力[9]；將高原鼠兔置于常氧室溫條件下適應(yīng)7 d，Northern雜交檢測hif-1α mRNA在多種組織中均有表達(dá)，并且表現(xiàn)出明顯的組織差異性[10]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)比較高原藏山羊和平原樂至黑山羊HIF-1α、VEGF165及其受體FLT-1和FLK-1基因的mRNA表達(dá)量的差異，進(jìn)而研究處于高寒低氧地區(qū)動物的環(huán)境適應(yīng)性和環(huán)境因素對其相關(guān)基因表達(dá)量的作用及影響，為進(jìn)一步深入了解環(huán)境因素與基因表達(dá)之間的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)所用的羊只均為健康成年的母山羊，藏山羊來自四川省理縣藏山羊養(yǎng)殖農(nóng)戶；樂至黑山羊購自四川省樂至縣天龍科技示范園。分別采集藏山羊和樂至黑山羊的垂體和肝臟組織樣本，標(biāo)記后放入液氮中保存。

1.1.2 試劑及耗材 總RNA提取試劑盒、RNA樣品保存液等購自天根生化科技（北京）有限公司；實(shí)時熒光定量試劑盒SsoFastTM EvaGreen Supermix、八聯(lián)管及配套管蓋均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；RT Reagents試劑盒、Ex Taq酶、pMD19-T Vector購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒及耗材均購自美國Axygen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件的一般線性模型程序進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析，采用Pfaffle方法處理數(shù)據(jù)，分析目的基因的相對表達(dá)量。不同實(shí)驗(yàn)組中mRNA相對表達(dá)量的差異顯著性通過t-檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA完整性及純度檢測

所提取的藏山羊和樂至黑山羊總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，A260 nm/A280 nm均在1.8～2.0之間，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，18 S RNA和28 S RNA條帶清晰可見（圖1），說明所提取的RNA完整性好，無明顯降解，能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 目的基因在2個山羊品種間的相對表達(dá)量分析

3 小結(jié)與討論

HIF-1α作為缺氧應(yīng)答的調(diào)控因子能夠廣泛激活參與缺氧相關(guān)生理反應(yīng)的眾多基因，是介導(dǎo)缺氧信號與一系列基因的轉(zhuǎn)錄激活的一個重要偶聯(lián)和調(diào)控因子，在缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[19，20]。本實(shí)驗(yàn)通過研究高原羊和平原羊之間受環(huán)境因素調(diào)控的基因表達(dá)量的差異，對其環(huán)境適應(yīng)性和基因間的相互作用及影響有了更深入的了解，希望能為今后對組織之間表達(dá)量差異以及受體作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

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