黨亞麗

摘?要：目的：土霉素是限制我國(guó)淡水魚(yú)深加工產(chǎn)品出口的關(guān)鍵抗生素之一；此外，由于水污染加重，淡水魚(yú)中藻毒素殘留問(wèn)題也很嚴(yán)重。研究和開(kāi)發(fā)同時(shí)快速檢測(cè)技術(shù)已成為當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。方法：鯽魚(yú)魚(yú)肉進(jìn)行不同前處理，利用高效液相色譜測(cè)定毒素殘留量。結(jié)果：土霉素和微囊藻毒素的最低檢測(cè)限分別為0.1μg/kg、5ng/L。質(zhì)量濃度范圍0.1～5.0μg/mL的土霉素、微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)分別為0.995、0.998。精密度分別為1.82%、1.68%；回收率范圍分別88.1%～102.8%、90.6%～105%。結(jié)論：對(duì)比酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒的檢測(cè)，2種方法結(jié)果沒(méi)有太大差別。

關(guān)鍵詞：土霉素；微囊藻毒素(MC-LR)；高效液相色譜；同時(shí)檢測(cè)

中圖分類號(hào)：TS254.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123(2013)10-0009-03

土霉素(OTC)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中治療活性氣單胞菌屬敗血癥及假單胞菌屬敗血癥的常用抗菌藥物之一[1]，微囊藻毒素(microcystin，MC-LR)是水體富營(yíng)養(yǎng)化引起藻類(藍(lán)藻)大量繁殖所釋放的毒素。土霉素和微囊藻毒素的過(guò)度使用和環(huán)境惡化會(huì)引起這些毒素在魚(yú)體中的蓄積并導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性，具有免疫抑制影響導(dǎo)致肝損害等副作用。

檢測(cè)土霉素的方法主要有固相萃取和高效液相色譜法[2]。檢測(cè)微囊藻毒素的方法主要有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法等[3-6]。目前沒(méi)有同時(shí)檢測(cè)魚(yú)體中這2種毒素的方法。本實(shí)驗(yàn)采用水洗、酸洗、堿洗、煮制、腌制5種不同的前處理方法后，建立1種能同時(shí)檢測(cè)土霉素和微囊藻毒素高效液相色譜方法。同時(shí)對(duì)比分析不同處理方法對(duì)殘留量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯽魚(yú)購(gòu)買于當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)。

乙腈、甲醇(色譜純)；磷酸二氫鈉。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KKQ-100E超聲波清洗器 杭州蕭山余祝超聲波設(shè)備廠；HWS-12恒溫水浴鍋 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；TAIKANG/R2002KE旋轉(zhuǎn)濃縮儀 上海互佳儀器設(shè)備有限公司；S10高速勻漿機(jī) 杭州諾丁科學(xué)器材有限公司；HLB固相萃取柱 上海楚定分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 水洗

鯽魚(yú)去刺取肌肉部分絞碎后，與4℃蒸餾水按3:1(mL/g)混合。用玻璃棒攪拌2min，4℃冷凍離心(10000×g，10min)。得到的沉淀按3:1(mL/g)加蒸餾水(4℃)，用玻璃棒攪拌2min，4℃冷凍離心(10000×g，10min)。得到的沉淀即是水洗脫腥魚(yú)糜。

1.3.1.2 酸堿洗

鯽魚(yú)去刺取肌肉部分絞碎后，按9:1(mL/g)加蒸餾水(4℃)，用勻漿機(jī)勻漿(10000r/min，30s)，魚(yú)漿用雙層紗布過(guò)濾除結(jié)締組織。調(diào)整pH值(酸提pH2.3，堿提pH11.8)，整個(gè)過(guò)程保證溫度低于10℃；pH值達(dá)到目的值后繼續(xù)攪拌提取蛋白質(zhì)30min；4℃冷凍離心(5000×g，20min)，去掉沉淀；調(diào)上清液pH值到5.5，沉淀蛋白質(zhì)；4℃冷凍離心(5000×g，20min)，下層沉淀即為酸堿法提取的鯽魚(yú)蛋白[7]。

1.3.1.3 煮制

鯽魚(yú)去刺取肌肉部分切片，清水洗凈。放入干凈玻璃器皿中，加蒸餾水在電磁爐上加熱至沸騰。取出放置室溫時(shí)絞碎備用。

1.3.1.4 腌制(濕腌)

鯽魚(yú)去刺取肌肉部分切片，清水洗凈，將其泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的鹽溶液中。蓋上保鮮膜常溫條件下腌制6h，腌制好后絞碎備用。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取上述前處理魚(yú)各5.0g于50mL三角瓶中，加入10mL 80%甲醇，超聲5min(80W，20kHz)，將甲醇提取液轉(zhuǎn)入離心管中，8000r/min離心10min；如此重復(fù)提取3次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)濃縮至約10mL，再8000r/min離心10min。取15mL甲醇加入ODS小柱內(nèi)進(jìn)行活化，用20mL超純水洗滌小柱，然后將離心樣品(1mL)轉(zhuǎn)ODS柱內(nèi)緩慢通過(guò)，用10%甲醇2mL洗滌柱子，再用含有0.1%三氟醋酸的甲醇溶液2mL解吸，收集解吸溶液于50mL燒杯中并置75℃水浴中揮發(fā)甲醇溶液，用超純水洗滌燒杯后轉(zhuǎn)入1mL刻度具塞比色管內(nèi)，調(diào)節(jié)pH值至中性。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，供HPLC分析。

1.3.3 色譜條件

Crosmosile ODS色譜柱(250mm×4.6mm)；流動(dòng)相A：0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0.0～4.5min、30% B，4.5～5.0min、60% B，5.0～7.8min、70% B，7.8～10.0min、95% B，10.0～13min 30% B；檢測(cè)波長(zhǎng)：λ1=238nm、λ2=355nm；流速1mL/min；

柱溫40℃。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)品系列配置及樣品測(cè)定

分別配制質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.5、1.0、5.0μg/mL土霉素(用甲醇稀釋)和微囊藻毒素(用20%甲醇稀釋)標(biāo)準(zhǔn)品溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品土霉素(40μg/mL)與微囊藻毒素(0.2μg/mL)按4:1(m/m)配置，避光貯存。進(jìn)樣量5μL，以色譜峰的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，與其對(duì)應(yīng)的溶液質(zhì)量濃度(ρ，μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)(進(jìn)樣量20μL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法和流動(dòng)相的選擇

根據(jù)土霉素和微囊藻毒素的紫外吸光特性，設(shè)定吸光波長(zhǎng)分別為土霉素238nm、微囊藻毒素355nm。最初選擇流動(dòng)相A：超純水；流動(dòng)相B：乙醇，洗脫程序?yàn)?.0～5.0min、10% B，5.0～10.5min、90% B，10.5～12.0min、10% B。土霉素出峰峰形良好，可是微囊藻毒素出峰基線不穩(wěn)。調(diào)整方法時(shí)根據(jù)國(guó)標(biāo)改變流動(dòng)相為乙腈和0.01mol/L磷酸二氫鈉[8]，根據(jù)1.3.3節(jié)洗脫程序，兩種毒素各峰分離完全，且峰形良好，保留時(shí)間穩(wěn)定，見(jiàn)圖1。

由圖2可知，在同樣色譜條件下，注入按1.3.4節(jié)配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)品，在9.8min左右出現(xiàn)1個(gè)峰，在波長(zhǎng)238nm處響應(yīng)值很高，分析可能波長(zhǎng)238nm比較低，很容易吸收微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度95%)中的雜質(zhì)。

2.2 方法的檢出限和線性范圍

按1.3.4節(jié)操作，回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為土霉素y1=1234.0ρ1＋1358.9，相關(guān)系數(shù)R2=0.9949；微囊藻毒素y2=35717ρ2＋11382，相關(guān)系數(shù)R2=0.9976；檢出限為土霉素0.1μg/kg、微囊藻毒素5.0ng/L。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取質(zhì)量濃度1.0μg/mL土霉素、微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定(n=6)，計(jì)算精密度。如表1所示，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為土霉素1.82%、微囊藻毒素1.68%。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

魚(yú)肉樣品進(jìn)行土霉素和微囊藻毒素0.1、0.5、5.0μg/mL 3個(gè)水平分別測(cè)定在鯽魚(yú)肌肉中的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 不同處理方法的比較

5種前處理方法中，水洗方法土霉素測(cè)定含量為142.4μg/kg，其余都超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)含量(我國(guó)水產(chǎn)品土霉素最大殘留限量為200μg/kg)[9]。原因可能是處理時(shí)受到了水質(zhì)污染。魚(yú)肉樣品中微囊藻毒素未檢出。

如圖3所示，在3min之前出峰可能是處理樣品摻入的雜質(zhì)，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)沒(méi)有大的影響。

3 討?論

用酶聯(lián)免疫反應(yīng)快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)提取出來(lái)的魚(yú)肉樣品，結(jié)果顯示水洗、酸洗、堿洗、煮制、腌制微囊藻毒素殘留量分別為1.26、1.04、2.64、0.35、0.31ng/L，由此可知不同處理方法，其殘留量不同。原因可能是不同處理方式，導(dǎo)致了魚(yú)肉蛋白變性，影響了毒素在固相萃取柱上的有效吸附從而導(dǎo)致回收率不同。由于殘留量少，在高效液相色譜中未能檢出，但在人體健康允許范圍內(nèi)該研究方法具有實(shí)際意義。本方法根據(jù)國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行改進(jìn)，主要探究了在魚(yú)肉中有可能存在的兩種毒素，并建立了高效液相色譜方法，其結(jié)果能滿足淡水魚(yú)加工處理的分析要求，可運(yùn)用在實(shí)際檢測(cè)中。

參考文獻(xiàn)：

[1] 秦峰, 陳國(guó)穎, 仇士林. 時(shí)間分辨熒光法高通量篩選魚(yú)肉組織中土霉素的殘留量[J]. 中國(guó)抗生素雜志, 2008, 33(9): 561-563.

[2] 龐國(guó)芳, 曹彥忠, 張進(jìn)杰, 等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留的研究[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2005, 24(4): 61-63.

[3] 吳偉文, 楊左軍, 顧浩飛, 等. 固相微萃取/高效液相色譜法測(cè)定水中的微囊藻毒素[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2007, 26(4): 545-547.

[4] 林瑤, 張瓊, 李一丹. 固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定水中痕量微囊藻毒素[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010, 20(9): 2174-2175.

[5] 虞銳鵬, 陶冠軍, 貢小清, 等. 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定背角無(wú)齒蚌體內(nèi)微囊藻毒素[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2007, 26(5): 671-674.

[6] 徐立紅, 陳加平, 黃兆輝, 等. 用蛋白磷酸酶抑制法測(cè)定水體中的微囊藻毒素類物質(zhì)[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 19(5): 536-539.

[7] HULTIN H O, KELLEHER S D. Process for isolating a protein composition from a muscle source and protein composition: US, 6288216 B1[P]. 2001-09-11. [2013-10-30 ]

[8] 遼寧省食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所. GB/T5009.116—2003 畜禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測(cè)定: 高效液相色譜法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[9] CARIGNAN G, CARRIER K, SVED S. Assay of oxytetracycline residues in salmon muscle by liquid chromagraphy with ultra vialet detection[J]. Journal of AOAC International, 1993, 76(2): 325-328.