顏春榮

摘 要：采用提取后添加法從提取溶劑、凈化方法、同位素內(nèi)標、基質(zhì)標曲等方面對超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中的磺胺類獸藥殘留進行基質(zhì)效應(yīng)的研究。結(jié)果表明：以乙腈為提取溶劑，經(jīng)MCX固相萃取柱凈化和液液萃取凈化可以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用基質(zhì)添加標準曲線和同位素內(nèi)標可以對基質(zhì)效應(yīng)的影響進行補償。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)；魚肉；磺胺類獸藥；基質(zhì)效應(yīng)

中圖分類號：O657.6 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123(2013)10-0017-04

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS-MS)技術(shù)以其操作簡便、準確度和靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點成為各種獸藥殘留的確證方法[1-4]。但復(fù)雜樣品共提取基質(zhì)成分和試樣前處理引入的外來雜質(zhì)會嚴重抑制或增強目標分析物在噴霧接口處的離子化，從而影響到檢測的選擇性和靈敏度，進而影響到分析結(jié)果的準確度和精密度[5-8]?；|(zhì)對分析方法準確測定分析物的能力的干擾稱為基質(zhì)效應(yīng)[9-10]?；前奉惈F藥的殘留檢測中存在較強的基質(zhì)效應(yīng)，特別是采用LC-MS-MS進行多殘留快速篩查[11-12]，但目前的相關(guān)研究較少。本研究以魚肉中磺胺類獸藥殘留為研究對象，建立超高壓液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法(UPLC-ESI-MS-MS)測定磺胺類獸藥殘留的方法，利用提取后基質(zhì)添加法從提取溶劑、凈化方法、使用內(nèi)標等方面進行基質(zhì)效應(yīng)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚肉樣品為市售產(chǎn)品；

磺胺脒(胍)、磺胺、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺多辛、磺胺甲惡唑、磺胺二甲異惡唑、磺胺喹噁啉、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯，2種內(nèi)標(13C6-磺胺甲基嘧啶、D4-磺胺嘧啶) 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；Cleanert MAS-Q試劑 博納艾杰爾公司；混合型陽離子交換(MCX)固相萃取柱 美國Waters公司；乙腈、甲醇、正己烷均為色譜純；甲酸、無水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

1290超高壓液相色譜儀 美國Agilent公司；API 4000＋串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀 美國AB公司；J-E高速冷凍離心機 美國Beckman公司；5418R小型低溫離心機 艾本德中國有限公司；氮吹儀 美國Organomation公司；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi Manschette公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；Elix超純水儀 美國Millipore公司；T18組織勻漿機 德國IKA公司；全自動固相萃取儀 北京普立泰科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

分別準確稱取10mg標準品于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成濃度為1000mg/L的標準儲備液，置于－20℃冰箱內(nèi)避光保存。分別精密吸取上述儲備液各適量，置同1容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸水溶液(1:9，m/m)，稀釋成質(zhì)量濃度為1000ng/mL的標準工作溶液，置于

－18℃冰箱內(nèi)避光保存。

1.3.2 不同溶劑提取方法的比較

稱取空白羅非魚肉5g，勻漿后分別加入20mL甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑，10000r/min均質(zhì)5min，超聲5min，加20g無水硫酸鈉，4℃條件下10000r/min離心10min，取上清液10mL，40℃條件下氮氣吹干后用10mL甲醇-0.1%甲酸水溶液(1:9，m/m)復(fù)溶，4℃條件下

13000r/min離心10min，用上清液配制混合標樣質(zhì)量濃度為5.0ng/mL的基質(zhì)標準溶液。每種溶劑設(shè)置3個平行。

1.3.3 不同凈化方法的比較

固相萃取凈化法參照SN/T 2580—2010《進出口蜂王漿中16種磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[13]，MCX固相萃取柱使用前采用5mL甲醇和5mL水活化，分別取1.3.1節(jié)中的5mL待凈化液上樣。上樣后用5mL甲醇-水(1:1，m/m)淋洗，抽干后用5%氨化甲醇5mL洗脫。洗脫液在水浴中氮吹至干，用1mL乙腈-0.1%甲酸溶液(1:4，m/m)復(fù)溶，過0.22μm濾膜。配制混合標樣質(zhì)量濃度為5.0ng/mL的基質(zhì)標準溶液。

液-液萃取法參照GB/T20759—2006《畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法》[14]，取5mL 1.3.1節(jié)中的待凈化液加乙腈飽和的正己烷5mL，旋渦振蕩30s，13000r/min離心5min，棄去正己烷層，過0.22μm濾膜。用下層溶液配制混合標樣濃度為5.0ng/mL的基質(zhì)標準溶液。

1.3.4 同位素內(nèi)標的應(yīng)用

分別精密吸取1.3.1節(jié)中的標準樣品工作液適量置容量瓶中，用1.3.3中通過固相萃取凈化法及液-液萃取法凈化的空白基質(zhì)溶液做溶劑，配制成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、10.0ng/mL和50.0ng/mL的混合標準工作液。準確吸取13C6-磺胺甲基嘧啶、D4-磺胺甲基嘧啶和D4-磺胺嘧啶儲備液各適量，使其在混合標準工作液中的質(zhì)量濃度為5.0ng/mL，上機待用。

1.3.5 液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液，B相選擇乙腈和甲醇進行比較；梯度洗脫程序A相：0～3min、90%～65%，3～10min、65%～40%，10～11min、40%～85%，11～12min、85%～90%，流速0.2mL/min，分析時間12min，柱溫30℃，進樣量10μL。

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模(MRM)；霧化電壓5500V；離子源溫度為600℃；氣簾氣壓力35psi；輔助加熱氣1壓力55psi；輔助加熱氣2壓力65psi；碰撞氣壓力8psi。

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)的評價方法

采用提取后添加法[15]，定量測定1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強度，計算2者相對比值來評價基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)。計算公式如下：

ME/%＝基質(zhì)溶液中分析物的峰面積/純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e×100

如果比值小于1.0，說明基質(zhì)對待測物的離子響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用；如果比值大于1.0，說明基質(zhì)的存在增強了待測物的離子響應(yīng)強度；如果比值等于1.0，說明待測物應(yīng)未受影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

經(jīng)與Luna 3? C18(150×2.0mm，3μm)和ZORBAX SB C18(2.1mm×100mm，1.8μm)色譜柱相比，ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)更擅長分離難以分離的堿性化合物，可獲得更出色的峰形、柱效和分離度(圖1)。同時梯度洗脫可以淋洗進樣后的色譜柱, 也可避免前1樣品殘留的后洗脫物對下1樣品的影響，避免基質(zhì)與目標物產(chǎn)生離子化競爭。質(zhì)譜離子源中的溫度和氣流速度會影響離子化效率，可以通過優(yōu)化軟件得到最佳參數(shù)。

按照時間順序，依次為磺胺脒(胍)、磺胺、磺胺醋酰、磺胺索嘧啶、D4-磺胺嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、13C6-磺胺甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲惡唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺二甲異惡唑、磺胺苯吡唑、磺胺氯吡嗪、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺硝苯。

2.2 不同提取溶劑對磺胺類獸藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)影響

經(jīng)甲醇、乙腈及乙酸乙酯提取的豬肉基質(zhì)提取液，添加2ng/mL基質(zhì)標準溶液進行測定，考察溶劑的種類對目標物峰面積的影響。分析結(jié)果表明，提取溶劑種類對豬肉基質(zhì)中磺胺類藥物的信號響應(yīng)影響較大。經(jīng)計算，甲醇、乙腈和乙酸乙酯提取豬肉中22種分析物的ME(圖2)，分別為13.4%～32.1%、22.1%～47.0%及29.0%～42.1%，由數(shù)據(jù)可以看出3種溶劑提取物的ME均小于1.0，說明基質(zhì)對待測物的離子響應(yīng)均產(chǎn)生抑制作用。其中甲醇提取物的ME最小，說明甲醇提取物基質(zhì)對目標物離子響應(yīng)的抑制程度最大。乙腈和乙酸乙酯提取物基質(zhì)對目標物離子響應(yīng)的抑制程度次之。

1～22依次為磺胺脒、磺胺、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺多辛、磺胺甲惡唑、磺胺二甲異惡唑、磺胺喹噁啉、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯。

基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的詳細作用機制尚不清楚，但目前認為共提取的基質(zhì)干擾物與分析物競爭電離是主要原因。本實驗選擇極性不同的3種溶劑，其中甲醇極性最強，乙酸乙酯極性最弱。根據(jù)相似相溶原理，甲醇提取的極性成分相對最多，因此甲醇提取的分析試液中基質(zhì)干擾成分相對最多，共流出時大大影響了磺胺類藥物在電噴霧接口的電離效率，故而其ME最明顯；而乙酸乙酯極性較弱，提取的油脂性成分較多，這類物質(zhì)可以增加噴霧的表面張力，降低了目標物的霧化效率，因而其ME也相對較強。經(jīng)比較，乙腈且具有沉淀蛋白的作用，極性適中，且有助于提高目標物的電離效率，對基質(zhì)效應(yīng)的影響最弱，是提取磺胺類藥物的合適溶劑。

2.3 不同凈化方法對磺胺類獸藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)影響

1～22依次為磺胺脒、磺胺、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺多辛、磺胺甲惡唑、磺胺二甲異惡唑、磺胺喹噁啉、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯。

經(jīng)乙腈提取的豬肉基質(zhì)溶液，進一步用MCX固相萃取小柱和液液萃取法凈化，濾液分別配制成2ng/mL基質(zhì)標準溶液進行基質(zhì)效應(yīng)考察。從圖3可以看出，與凈化前相比，兩種凈化方式都能夠有效去除大量基質(zhì)干擾成分，MCX固相萃取小柱的ME為32.0%～81.2%，液液萃取法的ME為36.0%～78.0%，2者受抑制程度差異不大。MCX小柱為陽離子交換和反相吸附混合型固相萃取柱，在將離子狀態(tài)的目標物吸附在柱體的同時，去除極性和非極性雜質(zhì)。液液萃取法是通過正己烷去除非極性的油脂類成分，但由于液液萃取法相對于MCX固相萃取法，沒有基質(zhì)濃縮的過程，因此基質(zhì)效應(yīng)的影響較小。從經(jīng)濟實惠和操作復(fù)雜程度來看，建議選擇液液萃取法用于豬肉中磺胺類獸藥殘留提取與凈化。

2.4 同位素內(nèi)標物對基質(zhì)標樣的線性、回收率、精密度的校正

取空白羅非魚肉，添加混合標樣濃度為25ng/g，做5個平行實驗，采用1.3.2節(jié)乙腈提取和1.3.3節(jié)液液萃取法凈化，計算回收率和精密度。表1中列出的是分別使用外標法和內(nèi)標法時，標準曲線線性相關(guān)系數(shù)以及濃。使用外標法時，線性相關(guān)系數(shù)均為0.99，使用內(nèi)標法時，除磺胺脒、磺胺和磺胺硝苯外，線性相關(guān)系數(shù)均可達0.999；使用內(nèi)標法的回收率明顯高于使用外標法的回收率；使用外標法時，精密度為15.0%～23.3%，使用內(nèi)標法時，精密度為4.7%～11.1%。數(shù)據(jù)表明使用同位素內(nèi)標對線性、回收率和精密度進行校正，可獲得重復(fù)性更好的結(jié)果，在很大程度上消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。同位素內(nèi)標不但可降低質(zhì)譜離子化時所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng), 還可以消除樣品前處理過程中出現(xiàn)的差異。

3 結(jié)?論

本研究結(jié)果表明，在利用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中的磺胺類獸藥殘留時，以乙腈為提取溶劑，經(jīng)MCX固相萃取柱凈化和液液萃取法均可以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，從經(jīng)濟實惠和操作復(fù)雜程度來看，建議選擇液液萃取法用于豬肉中磺胺類獸藥殘留提取與凈化。采用基質(zhì)添加標準曲線和同位素內(nèi)標可以對基質(zhì)效應(yīng)的影響進行補償，獲得更好的線性相關(guān)性、更高的回收率和精密度。

參考文獻：

[1] 郭黎明, 朱奎, 江海洋, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞肝中殘留的四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物[J]. 色譜, 2009, 27(4): 412-416.

[2] 劉佳佳, 佘永新, 劉洪斌, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物源性食品中24種磺胺類藥物殘留[J]. 分析試驗室, 2011, 30(2): 9-13.

[3] BARHAM R, BLACK W D, CLAXTON J, et al. Rapid assay for detecting sulfonamidesin tissues of slaughtered animals[J]. Journal of Food Protection, 2001, 64(10): 1565-1573.

[4] 劉芃巖, 姜寧, 王英峰, 等. 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞肉中殘留的磺胺類和氟喹諾酮類獸藥[J]. 色譜, 2008, l26(3): 348-352.

[5] MATUSZEWSKI B K. Standard line slopes as a measure of a relative matrix effect in quantitative HPLC-MS bio-analysis[J]. Journal of Chromatography B, 2006, 830: 293-300.

[6] FU I, WOOIF E J, MATUSZEWSKI B K. Effect of the sample matrix on the determination of indinavir in human urine by HPLC with turbo ion spray tandem mass spectrometric detection[J]. Journal of Pharmaceut Biomed, 1998, 18: 347-357.

[7] 賈彥波, 王清清, 宋海峰. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)分析生物樣品時的基質(zhì)效應(yīng)研究[J]. 軍事醫(yī)學, 2011, 35(2): 149-151.

[8] 劉明艷, 姚志紅, 張依, 等. 兩種前處理方法對LC-MS-MS測定家兔血清中淫羊藿黃酮類化合物基質(zhì)效應(yīng)的影響[J].分析測試學報, 2011, 30(9): 1006-1012.

[9] 任雪冬, 劉成雁, 林雪征. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動物源性食品中激素殘留所遇到問題的探討[J]. 理化檢驗: 化學分冊, 2011, 47(7): 872-876.

[10] 向平, 沈敏, 卓先義. 液相色譜-質(zhì)譜分析中的基質(zhì)效應(yīng)[J]. 分析測試學報, 2009, 28(6): 753-756.

[11] 厲文輝, 史亞利, 高立紅, 等. 加速溶劑萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測魚肉中喹諾酮、磺胺與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[J]. 分析測試學報, 2010, 29(10): 987-992.

[12] 徐偉東, 秦峰, 李曉雯, 等. 基質(zhì)固相分散-高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測定豬肉中22種磺胺類藥物的殘留[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報, 2013, 4(1): 141-149.

[13] 中華人民共和國浙江出入境檢驗檢疫局. SN/T 2580—2010 進出口蜂王漿中16種磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[14] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、中國國家標準化管理委員會. GB/T20759—2006 畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測定: 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2006.

[15] MATUSZEWSKI B K, CONSTANZER M L, CHAVEZ-ENG C M. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS-MS[J]. Anal Chem, 2003, 75(13): 3019-3030.