★ 鄒江斌 盧建中 張娟娟 (江西中醫(yī)學(xué)院 南昌330004)

顯微鑒定是中藥材四大傳統(tǒng)鑒定方法之一。制作完整、均勻而薄的組織切片是確?？蒲泄ぷ髡吣軌驕?zhǔn)確清晰看清組織構(gòu)造，從而辨別藥材真?zhèn)蔚那疤釛l件。石蠟切片具有簡(jiǎn)單易行，切片效果好，可以永久保存，普遍藥材都適用等優(yōu)點(diǎn)從而被廣泛應(yīng)用。由于實(shí)驗(yàn)材料，試劑及方法等因素的影響，只要實(shí)驗(yàn)過(guò)程中某一過(guò)程處理不當(dāng)都可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，在實(shí)際操作中還得對(duì)實(shí)驗(yàn)各個(gè)環(huán)節(jié)加以注意。石蠟切片過(guò)程依次包括軟化(干硬藥材)、取材、固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋，切片，貼片與烤片、脫蠟、復(fù)水、染色、脫水、透明、封片等。本文總結(jié)了石蠟切片的某些過(guò)程的方法學(xué)改良和注意事項(xiàng)。

1 軟化

軟化是指對(duì)干、硬藥材的前處理。實(shí)際工作中由于季節(jié)及地域的限制，我們很難及時(shí)弄到新鮮藥材，因此我們常常采用干燥藥材，這時(shí)我們就要對(duì)藥材進(jìn)行軟化。對(duì)于一些硬度不是很大的藥材我們可以通過(guò)水浸泡，而對(duì)于藥材硬度較大的藥材就要通過(guò)其它方法處理。據(jù)宗希明［1］報(bào)道，部分干燥藥材采用適當(dāng)溶劑軟化可以得到良好效果。如一般質(zhì)地軟，含薄壁組織較多，木化組織較少的材料可選用15% －20%甘油、50% －70%乙醇、甘油－乙醇溶液、冰乙酸－乙醇溶液浸泡軟化。質(zhì)地硬，組織排列密度大，含纖維、石細(xì)胞、木栓化、木質(zhì)化組織較多的材料可選用15% －20%甘油、甘油－乙醇溶液、18%氨水溶液浸泡軟化。對(duì)于十分堅(jiān)硬，富含石細(xì)抱，纖維素性和木質(zhì)化的材料，可選用36%氨水溶液，置于溫箱中(30 －40℃)浸泡軟化。全部木栓化和本質(zhì)化的木材類，可用37%氫氟酸浸泡軟化。其后程蓮銀［2］舉了10 種有代表性的干硬藥材的軟化處理方法。婁玉霞［3］通過(guò)單因素考察發(fā)現(xiàn)軟化方法，軟化溫度，軟時(shí)間對(duì)藥材軟化效果存在影響。

2 取材

取材過(guò)程主要涉及到取材部位和取材大小。取材部位一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定，大小要適當(dāng):根及莖類一般直徑≤5mm，切取成5 －10mm 小段，對(duì)于稍粗藥材可以將其對(duì)剖成1/2或1/4 大小;葉類取過(guò)中脈處，與中脈成直角切成寬2 －5mm，長(zhǎng)5 －8mm 小片。取材過(guò)大，固定液及石蠟難以進(jìn)入，同時(shí)水分也不易脫掉。

3 固定

對(duì)于新鮮藥材必須要經(jīng)過(guò)固定，其目的在于殺死及固定細(xì)胞，從而使組織保持原來(lái)的結(jié)構(gòu)。目前使用較多的為混合固定液:FAA 固定液、卡諾氏固定液、納瓦興氏固定液、波因固定液、里根規(guī)定液、酒精－福爾馬林液、鉻酸－醋酸固定液鉻酸、鉻酸－餓酸－醋酸固定液。其中FAA 固定液最為常用，由50%或者70% 酒精90mL、冰醋酸5mL 和福爾馬林5mL 配置而成［4］。由于它既可以作為固定液由可以用于保存藥材，因此固定時(shí)間沒(méi)有限制。固定液的體積應(yīng)為組織總體積的10 －15 倍［5］。

4 沖洗、脫水、透明及融蠟過(guò)程

固定之后，藥材應(yīng)置于流水中沖洗數(shù)小時(shí)，避免藥材中殘留的固定液直接影響染色效果。脫水過(guò)程是整個(gè)石蠟切片中最為重要的環(huán)節(jié)，藥材中水分是否被完全脫離直接影響到后面透明及融蠟過(guò)程中二甲苯及石蠟進(jìn)入，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要不定期更換脫水液以保證脫水液的濃度。脫水液一般從30%濃度開始，并且級(jí)別差盡量要小，避免藥材皺縮。同時(shí)我們要在脫水過(guò)程中注意控制脫水時(shí)間，否則會(huì)出現(xiàn)藥材過(guò)度硬化，直接影響后面的切片過(guò)程，每級(jí)脫水時(shí)間一般控制在10 －20 分鐘。如果當(dāng)天不能處理完脫水，透明過(guò)程，則放置70%乙醇中過(guò)夜。透明采取逐步加二甲苯法(1/2 無(wú)水乙醇+1/2 二甲苯、純二甲苯2 次)，透明要充分，直到完全透明為止，時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則材料易脆。融蠟過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，一般2 －3 天，期間我們要不停加入蠟屑，直至不在溶解為止，此過(guò)程在水浴鍋中進(jìn)行，溫度為40℃。然后將藥材取出放入已經(jīng)完全熔融的純蠟中2 次，每次時(shí)間為2 －3 小時(shí)，該過(guò)程在恒溫箱中進(jìn)行，溫度高于石蠟熔點(diǎn)1 －2℃。

據(jù)馬國(guó)祥等［6］研究發(fā)現(xiàn):利用聚乙二醇代替石蠟制石斛切片效果良好，解決了用石蠟切片時(shí)不足。徐珞珊等［7］利用加溫方法促使脫水、透明及石蠟過(guò)程在4 －5 小時(shí)完成。據(jù)報(bào)道［8］“生物快速處理儀”處理各級(jí)脫水、透明的時(shí)間只需15 －30 分鐘，可在較短的時(shí)間內(nèi)完成切片的全過(guò)程。

5 包埋

包埋前需要準(zhǔn)備好紙盒，其大小一般為5cm ×2cm ×1.5cm。將藥材連同熔融石蠟迅速?gòu)暮銣叵渲腥〕龅谷氚窈兄?，用解剖針將藥材立于盒?nèi)不倒再撤去。如果藥材周圍有氣泡存在，將解剖針?lè)旁诰凭珶羯献茻?，迅速插向氣泡致其排出。如果想石蠟?zāi)苎杆倮鋮s，可以將紙盒放入冰水混合物中，同時(shí)可以防止壓塊中間凹陷出現(xiàn)空洞。鄧興峰［9］報(bào)道了石蠟切片法中細(xì)長(zhǎng)或薄片狀材料的包埋方法:先在包埋紙盒底部形成約1mm 厚的軟蠟層;待軟蠟層凝固前，再向紙盒中倒?jié)M熔蠟，然后迅速將滲好蠟的材料直立地放入熔蠟中，并將材料輕壓在紙盒底部的軟蠟層上。

6 切片與粘片

切片時(shí)厚度的把握對(duì)能否形成連續(xù)蠟帶至關(guān)重要，一般控制在9 －10μm，太厚則切片容易卷縮，不能形成蠟帶。同時(shí)調(diào)整好刀片與蠟塊角度，一般刀刃與蠟塊表面呈5°，以保證切下來(lái)的藥材為橫切面，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。石蠟切片法中傳統(tǒng)的貼片方法主要有2 種:一種是用燙片臺(tái)法，一種是溫水撈取法。但是在但在少量切片時(shí)可直接在涂有甘油蛋白的載玻片上加少量蒸餾水，將切片放在上面，載玻片直接在酒精燈上加溫，至切片完全展開為止，倒去多余水分入溫箱中烤干。注意貼片位置為載玻片兩對(duì)角線交點(diǎn)處，以保證制片科學(xué)美觀。羅艷蕊等［10］通過(guò)實(shí)驗(yàn)，摸索得到一種快速，展片效果好的貼片方法:蠟帶在放入溫水之前，先放入事先配置好的濃度為45% －50%乙醇中片刻，然后再放入溫水中。以上貼片都在載玻片上涂有粘合劑，據(jù)任成林［11］經(jīng)驗(yàn)介紹不使用粘合劑同樣可以制作質(zhì)量穩(wěn)定，優(yōu)片率高的切片:其方法為一定要保證載玻片干凈，切片不要太厚，撈片時(shí)防止切片皺褶和含有氣泡，及時(shí)除去載玻片上水分，迅速放入橫溫箱中，橫溫箱的溫度應(yīng)高于所用石蠟熔點(diǎn)1 －2℃，烤片4 －6 小時(shí)。后來(lái)王寶榮等［12］人同樣報(bào)道了類似方法。

7 脫蠟與染色

切片染色時(shí)脫蠟一定要徹底，否則會(huì)導(dǎo)致不易著色，在同一切片上出現(xiàn)著色深淺不一。當(dāng)載玻片上無(wú)明顯蠟塊且清晰透明即可。如果想加快脫蠟時(shí)間，可以將二甲苯放在60℃恒溫箱中加溫30 分鐘。，然后再將烘好的切片放入二甲苯中，這樣不僅縮短了脫蠟時(shí)間，還降低了切片因脫蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致掉片［13］。通常藥材組織切片所用的染色劑為番紅(50%乙醇配置，濃度1%)，固綠或亮綠(乙醇配置，濃度0.5%)。番紅可以將木質(zhì)化組織染成紅色，快綠或亮綠可以將細(xì)胞壁染成綠色。番紅染色通常要24 小時(shí)以上，當(dāng)切片放置50%乙醇中洗脫，不完全褪色即可。固綠染色時(shí)間的把握對(duì)整體切片成敗起著決定性作用。染色時(shí)間太長(zhǎng)，則組織會(huì)被染得太綠不利于觀察，如果太短，則組織著不上色，因此一般控制在30 －40 秒。染好的切片應(yīng)妥善保存，更應(yīng)避免日光照射，否則切片容易褪色。

8 中性樹膠封藏

切片封藏前要配置好中性樹膠，其方法為用二甲苯稀釋中性樹膠，用玻棒蘸取中性樹膠，當(dāng)樹膠成滴狀緩慢流下即可。封片時(shí)要注意不要產(chǎn)生氣泡，如果產(chǎn)生氣泡則用灼燒熾熱的解剖針從蓋玻片一側(cè)將氣泡引出。封好片后，放于37℃溫箱烘干，永久保存。

9 小結(jié)

常規(guī)的石蠟切片步驟并不復(fù)雜，但是想要做出一張優(yōu)秀的石蠟切片，需要我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格控制好每一環(huán)節(jié)，因?yàn)槠渲械拿恳粋€(gè)環(huán)節(jié)都是相互關(guān)聯(lián)、一環(huán)套一環(huán)的，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出錯(cuò)，都會(huì)影響最終制片的質(zhì)量。同時(shí)我們還需要根據(jù)不同藥材，適當(dāng)改進(jìn)，從而才能得到我們所需要的切片。

［1］宗希明，韓樹盛.石蠟切片中干硬中藥材軟化處理方法［J］.佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，17(1):34 －35.

［2］程蓮銀.干、硬中藥材作石蠟切片的技術(shù)處理方法［J］. 中國(guó)藥師，2000，3(6):374.

［3］婁玉霞，蔣巧鳳.干燥中藥材石蠟制片的方法研究［J］.河南中醫(yī)藥學(xué)刊，1999，14(1):26 －27.

［4］李正理.植物制片學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，1973:9 －18.

［5］侯春春，徐水.淺析影響石蠟切片質(zhì)量的關(guān)鍵因素［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(23):94 －98.

［6］徐珞珊，馬國(guó)祥，陳世忠，等.聚乙二醇制作植物切片方法［J］.中國(guó)中藥雜志，1995，20(5):264 －265.

［7］李卿洲. 藥材的快速石蠟切片法簡(jiǎn)介［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，1966，13(8):610 －612.

［8］劉惠娟，李萍，徐路珊.制作中藥材石蠟切片的幾點(diǎn)方法［J］. 中藥材，1997，20(5):269 －270.

［9］鄭興峰.石蠟切片法中細(xì)長(zhǎng)或薄片狀材料的包埋［J］. 生物學(xué)雜志，2003，(4):41 －43.

［10］羅艷蕊，孔翔會(huì)，李衛(wèi)國(guó)，等.石蠟切片貼片法的改良［J］. 生物學(xué)雜志，2002，19(6):38.

［11］任成林.常規(guī)石蠟切片不用粘貼劑［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，1994，20(1):38 －39.

［12］金延明王寶榮.植物組織切片不使用粘貼劑的方法［J］.中國(guó)中藥雜志，1995，20(3):140.

［13］鄭燕璇，王曉鴻，茍新敏.石蠟切片脫蠟方式的比較［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2009，20(14):211.